Departamento de Ingeniería Química Desarrollo y evaluación de tecnologías para la producción de glucosa por vía enzimática a partir de un biocatalizador termoestable en la UEB Derivados Chiquitico Fabregat , Julio 2021 Autora: Amanda Acosta Solares Tutor: Dr. C. Omar Pérez Navarro , July 2021 Departament of Chemical Engineering Author: Amanda Acosta Solares Thesis Director: Dr. C. Omar Pérez Navarro Development and evaluation of technologies for the enzymatic production of glucose from a thermostable biocatalyst at the UEB Derivados Chiquitico Fabregat Este documento es Propiedad Patrimonial de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, y se encuentra depositado en los fondos de la Biblioteca Universitaria “Chiqui Gómez Lubian” subordinada a la Dirección de Información Científico Técnica de la mencionada casa de altos estudios. Se autoriza su utilización bajo la licencia siguiente: Atribución- No Comercial- Compartir Igual Para cualquier información contacte con: Dirección de Información Científico Técnica. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní. Km 5½. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP. 54 830 Teléfonos.: +53 01 42281503-1419 Pensamiento «Un sutil pensamiento erróneo puede dar lugar a una indagación fructífera que revela verdades de gran valor.» Isaac Asimov Agradecimientos Agradecimientos A Dios por ser mi guía. A mi familia por su extraordinario ejemplo y apoyo incondicional, en especial a mis abuelos por el sacrificio y esfuerzo que han dedicado y sus sabios consejos. A Onay por su comprensión, aliento y la confianza transmitida. A mis compañeros por hacer de estos años una experiencia maravillosa. A mi tutor Omar por la fortaleza, exigencia, orientación y ayuda científica. A Mariano por el gran apoyo y disposición. A todos los profesores que con su sabiduría han contribuido en mi formación. A los compañeros del CUM en especial a Carlos por la paciencia y dedicación. A todas las personas que me apoyan y me quieren bien. Resumen RESUMEN Debido a la necesidad del inceremento de la calidad y la eficiencia de la producción de glucosa en la UEB Chiquitico Fabregat, se evaluó la alternativa de inversión enzimática a partir del desarrollo de las modificaciones tecnológicas correspondientes. Se seleccionó el biocatalizador PpABfrA dada su elevada termoactividad y termoestabilidad, además de las buenas propiedades para su reúso. Con vistas a su utilización a escala industrial, se elaboró un procedimiento de optimización mediante la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) que considera la relación de los factores experimentales más influyentes en condiciones reactivas. El ajuste de los resultados experimentales reportados para este biocatalizador a un Diseño Compuesto Central (DCC) arrojó un porciento de hidrólisis óptimo de 85,6 % alcanzado en 12 h y una concentración inicial de sacarosa de 1,75 M, condiciones que se consideraron para el desarrollo tecnológico. Del análisis de los criterios de escalado aplicados a la propuesta de rector piloto, mantener el cizallamiento del biocatalizador constante, resultó ser la alternativa operacional más acertada. A nivel industrial se escalaron las condiciones pilotos a un volumen de 10 m3. Además, se diseñó el equipamiento necesario con optimización económica del número de efectos de evaporación y se consideró el acondicionamiento del existente. La operación en condiciones de máximo aprovechamiento de la capacidad instalada arrojó un valor de la producción que supera en 1,51 veces al de la hidrólisis ácida y un tiempo de recuperación de 1,8 años. De acuerdo a las proyecciones existentes, se propuso una producción anual de 1 432,5 t de glucosa como mínima capacidad permisible para el proceso, con un tiempo de recuperación inferior a 5 años. Summary Summary Due to the need to improve the quality and efficiency of glucose production in the UEB Chiquitico Fabregat, the alternative of enzymatic inversion was evaluated by developing the corresponding technological modifications. The PpABfrA biocatalyst was selected due to its high thermoactivity and thermostability, in addition to its good reuse properties. With a view to its use at industrial scale, an optimization procedure was developed using Response Surface Methodology (RSM) that considers the relationship of the most influential experimental factors under reactive conditions. The adjustment of the experimental results reported for this biocatalyst to a Central Composite Design (CCD) yielded an optimum hydrolysis percentage of 85,6 % reached in 12 h and an initial sucrose concentration of 1,75 M, conditions that were considered for the technological development. From the analysis of the scaling criteria applied to the pilot rector proposal, keeping the biocatalyst shear constant turned out to be the most successful operational alternative. At the industrial level, the pilot conditions were scaled up to a volume of 10 m3. In addition, the necessary equipment was designed with economic optimization of the number of evaporation effects and the retrofitting of the existing equipment was considered. Operation under conditions of maximum utilization of the installed capacity yielded a production value 1.51 times higher than that of acid hydrolysis and a recovery time of 1,8 years. According to existing projections, an annual production of 1 432,5 t of glucose was proposed as the minimum allowable capacity for the process, with a recovery time of less than 5 years. Índice ÍNDICE INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1 CAPÍTULO 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 4 1.1. Edulcorantes ................................................................................................................. 4 1.1.1. Azúcares invertidos ............................................................................................... 4 1.2. Mecanismo cinético de las invertasas .......................................................................... 5 1.3. Métodos para la obtención de glucosa a partir de azúcar refino .................................. 7 1.3.1. Hidrólisis ácida ...................................................................................................... 7 1.3.1.1. Revisión tecnológica y parámetros fundamentales del proceso de obtención de glucosa en la UEB Derivados Chiquitico Fabregat ................................................ 8 1.3.1.1.1. Consecuencias de las dificultades operacionales en el desarrollo del proceso ................................................................................................................... 10 1.3.2. Por intercambio iónico ........................................................................................ 10 1.3.3. Empleo de la enzima invertasa ............................................................................ 10 1.4. La Metodología de Superficie de Respuesta para la optimización experimental ...... 13 1.4.1. Modelo de segundo orden ................................................................................... 14 1.4.2. Diseños de segundo orden para ajustar superficies de respuesta ........................ 15 1.5. Escalado de reactores agitados................................................................................... 16 1.6. Intercambiadores de calor .......................................................................................... 18 1.6.2. Evaporadores ....................................................................................................... 20 1.6.2.1. Principios de Rillieux ................................................................................... 20 1.6.2.2. Evaporadores de tubos cortos verticales ....................................................... 21 1.6.2.3. Diseño y evaluación de un múltiple efecto evaporador ................................ 21 1.7. Conclusiones Parciales .............................................................................................. 23 CAPÍTULO 2. PROPUESTA METODOLÓGICA PARA LA CONDUCCIÓN EXPERIMENTAL Y OPTIMIZACIÓN DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA SACAROSA ......................................................................................................................... 24 2.1. Selección de un biocatalizador adecuado para la hidrólisis del azúcar refino ........... 24 2.2. Propuesta metodológica para la optimización experimental mediante la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) ................................................................................... 27 2.3. Optimización de la hidrólisis de la sacarosa a partir de los resultados experimentales previos ............................................................................................................................... 30 2.4. Propuesta de escalado de la reacción biocatalizada por PpABfrA ............................ 33 Índice 2.4.1. Análisis de las consecuencias de la aplicación de los diferentes criterios de escalado para la operación del biorreactor piloto (500 L) ............................................. 34 2.4.2. Requerimientos de transferencia de calor para el biorreactor piloto ................... 37 2.5. Conclusiones Parciales .............................................................................................. 39 CAPÍTULO 3. PROPUESTA TECNOLÓGICA, ADAPTACIÓN Y EVALUACIÓN TÉCNICA-ECONÓMICA ................................................................................................... 40 3.1 Desarrollo de tecnologías para la inversión enzimática en la UEB Derivados Chiquitico Fabregat ............................................................................................................................ 40 3.1.1. Escalado de la hidrólisis enzimática.................................................................... 40 3.1.2. Selección, adaptación y diseño del equipamiento para la preparación del sustrato ....................................................................................................................................... 42 3.1.3. Concepción tecnológica para la concentración del licor invertido ..................... 49 3.1.3.1. Intercambiador de calor para el calentamiento del licor invertido ............... 57 3.2. Análisis técnico – económico de la tecnología propuesta ......................................... 60 3.2.1. Costo de inversión ............................................................................................... 60 3.2.2. Costos de producción asociados a la hidrólisis ácida y enzimática .................... 64 3.2.3. Indicadores económicos y de rentabilidad del proceso ....................................... 65 3.2.3.1. Parámetros operacionales del funcionamiento de la planta a la mínima capacidad de producción anual permisible ................................................................ 68 3.3. Conclusiones Parciales .............................................................................................. 69 CONCLUSIONES ................................................................................................................ 70 RECOMENDACIONES ...................................................................................................... 71 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 72 ANEXOS .............................................................................................................................. 76 Introducción 1 INTRODUCCIÓN Los azúcares o siropes invertidos son edulcorantes elaborados por hidrólisis de una solución de sacarosa. Los beneficios económicos y demandas de estos productos hacen de sus procesos productivos una prioridad como fuente impulsora del desarrollo económico. La fructuosa es el azúcar más dulce de los edulcorantes naturales que unido a su gran estabilidad en alimentos ácidos y bebidas, constituye una alternativa atractiva al empleo de la sacarosa (Hannover and White, 1993). De acuerdo a estas propiedades alcanza una gran aplicabilidad en la elaboración de dulces y bebidas refrescantes, mientas que la glucosa, con un poder edulcorante menor que la sacarosa, tiene un amplio mercado en la industria química, farmacéutica y alimentaria, constituyendo una fuente de materia prima fundamental para otras producciones. A nivel global una de las principales fuentes de obtención de glucosa es a partir del azúcar refino, al igual que el almidón de maíz como sustratos más utilizados; donde la inversión se logra a partir de la acción de un ácido a temperatura elevada, por intercambio iónico o por la presencia de la enzima invertasa (Díaz y col., 2020). En Cuba, la producción de glucosa se desarrolla en la UEB Gydema Glucosa de Cienfuegos a partir del almidón de maíz, tanto por hidrólisis ácida como enzimática; y a partir de la hidrólisis ácida del azúcar refino en la UEB Derivados Chiquitico Fabregat ubicada en Villa Clara y en la UEB Argentina de Camagüey. El polo científico-productivo Chiquitico Fabregat posee un amplio plan de producción encaminado a satisfacer las necesidades del país con la disposición de aprovechamiento de sus capacidades potenciales y de optimización de sus procesos con la introducción de adelantos científicos-técnicos. Entre ellas, cuenta con una planta de derivados para la obtención de glucosa y sirope rico en fructosa. Esta lleva a cabo el proceso productivo con una tecnología de origen nacional, donde se realiza la hidrólisis ácida de la sacarosa, sin embargo, este método de inversión, trae consigo una serie de inconvenientes que afectan la calidad y rendimiento del producto final (Kurup et al., 2005). Dado los inconvenientes de la inversión mediante el empleo de un ácido a temperatura elevada unido con dificultades operacionales en las diferentes etapas del proceso, los niveles productivos de glucosa anuales son insuficientes para satisfacer la demanda actual de este producto como materia prima para la producción de sorbitol. Introducción 2 Resultados obtenidos con el empleo de la hidrólisis enzimática de la sacarosa demuestran un aumento del rendimiento del proceso superior a 1,5 veces al reportado con la utilización de un ácido (Cortés y col., 2020 a), además de ofrecer otras ventajas como: mayor estabilidad química y microbiológica de la glucosa; y la eliminación de los procesos corrosivos, los productos coloreados y la generación de cenizas. La utilización de la enzima invertasa soluble, a pesar de reportar resultados satisfactorios en cuanto a la operación de hidrólisis, presenta como principal desventaja económica la no recuperación y separación del sistema de reacción. (Cortés y col., 2020 b) determinaron la concentración de enzima óptima para la inversión empleando la invertasa sumergida a escala de laboratorio, resultados que demuestran el elevado consumo de la enzima sin recuperación cuando se operan volúmenes a escala industrial. Teniendo en cuenta los criterios anteriores, la utilización de las enzimas inmovilizadas permite la reutilización continua del biocatalizador a diferencia de las precipitaciones de enzimas solubles, además de presentar una mayor termoestabilidad, fácil separación de las mezclas de reacción y la posibilidad de emplear una alta actividad enzimática por volumen del reactor (Hanfeld et al., 2009). La implementación de una tecnología enzimática capaz de operar a elevadas temperaturas con una termoestabilidad que permita la reutilización del biocatalizador constituye una alternativa novedosa desde el punto de vista técnico- económico. La propuesta tecnológica para la obtención de glucosa por esta vía implica cambios en las etapas del proceso de disolución e inversión, además de la concepción de una nueva etapa para la concentración del licor invertido. Atendiendo a estos antecedentes se formula el siguiente Problema Científico: No se dispone de una tecnología adecuada que garantice una producción de glucosa que satisfaga la demanda y los indicadores requeridos en calidad de materia prima para la producción de sorbitol. Dada la necesidad de realizar este estudio se plantea la siguiente Hipótesis del trabajo: Si se desarrollan y evalúan tecnologías correspondientes a las modificaciones para la implementación de la inversión enzimática a partir de un biocatalizador de enzima invertasa inmovilizada, es posible elevar los niveles de rendimiento y calidad de la glucosa obtenida con reflejo en un aumento de las capacidades productivas anuales. Introducción 3 Siendo entonces el Objetivo General de la presente investigación: Evaluar la producción de glucosa por vía enzimática a partir del desarrollo de las modificaciones tencnológicas en la UEB Derivados Chiquitico Fabragat. Para el cumplimiento del Objetivo General se plantean como Objetivos Específicos: 1. Seleccionar un catalizador de enzima de invertasa inmovilizada en un soporte adecuado según la finalidad de los productos. 2. Establecer las condiciones óptimas de reacción con el biocatalizador termoestable PpABfrA desarrollado en CIGB de Sancti Spíritus. 3. Diseñar el equipamiento correspondiente a la modificación tecnológica para la inversión enzimática. 4. Determinar los indicadores técnico - económicos y de rentabilidad para la producción industrial de glucosa enzimática. 5. Realizar análisis de sensibilidad para el establecimiento de las capacidades anuales según la demanda de glucosa y las proyecciones existentes. Con el desarrollo de la investigación se lograron Aportes desde el punto de vista práctico y metodológico, entre los que se destacan fundamentalmente: - Una metodología para la optimización de las variables en condiciones iniciales de búsqueda e investigación, que incluye un plan exploratorio experimental para la selección de los factores más influyentes y su mejor comportamiento dentro de la región de estudio adecuada desde el punto de vista económico y operacional. - La selección y diseño de las tecnologías para la producción de glucosa por vía enzimática en la UEB Chiquitico Fabregat que incluye la implementación de una metodología de cálculo para la optimización económica del número de vasos de un múltiple efecto de evaporación. - Evaluación técnico-económica del desarrollo tecnológico considerando una proyección anual de producción de acuerdo a la demanda, con resultados económicos satisfactorios. Capítulo 1. Revisión bibliográfica 4 CAPÍTULO 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Edulcorantes Los edulcorantes se encuentran entre los principales insumos de interés industrial, y dada su capacidad endulzante, son utilizados en la elaboración de una gran variedad de alimentos y bebidas. Los tipos de edulcorantes más comunes y conocidos son los azúcares, dentro los cuales se encuentran fundamentalmente la sacarosa y la glucosa como constituyentes de carbohidratos más complejos conocidos como polisacáridos, entre los que podemos mencionar: la celulosa, el almidón, las pectinas, el glucógeno, las fructanas, entre otros (García y col., 2000). El poder edulcorante de una sustancia se refiere a su capacidad de producir la sensación de dulzor al interactuar con las papilas gustativas y se mide tomando como base de comparación el dulzor de la sacarosa, a la que se le atribuye un valor relativo de 1 o de 100; es decir, si una sustancia presenta un poder edulcorante de 2, significa que dicha sustancia es dos veces más dulce que la sacarosa (Badui, 1997). El dulzor que presentan los edulcorantes se ve afectado por varios factores como: la temperatura, la concentración y la presencia de otros compuestos; por ejemplo, cuando los azúcares se disuelven en agua, se presentan reacciones de mutarrotación y se produce una mezcla de tautómeros con diferente dulzor, esto se observa en las soluciones de fructosa recién preparadas, las que son más dulces que las soluciones de fructosa que se dejan en reposo y alcanzan su equilibrio tautomérico. La temperatura afecta de manera inversa la capacidad endulzante de los carbohidratos, un ejemplo claro es, que se ha comprobado que la fructosa es más dulce a temperaturas bajas, propiedad que se aprovecha en la elaboración de bebidas refrescantes; por otro lado, también se ha establecido que jarabes de glucosa y de sacarosa al 40 % presentan el mismo grado de dulzor. Dentro de otros factores que influencian el dulzor se encuentran: la viscosidad, la presencia de sales, ácidos y algunos polímeros; por ejemplo, el alcohol aumenta el poder edulcorante de la sacarosa, mientras que la carboximetilcelulosa y el almidón lo reducen, el maltol y el etil maltol intensifican la dulzura de muchos azúcares (Rodríguez, 2016). 1.1.1. Azúcares invertidos La sacarosa se produce naturalmente como producto de la polimerización de la glucosa y la fructosa por un enlace glucosídico. Este disacárido no reductor, proporciona muchas Capítulo 1. Revisión bibliográfica 5 cualidades deseables en términos de dulzura, textura, y capacidad de transformarse entre los estados amorfo y cristalino. La hidrólisis de la sacarosa resulta en azúcar invertido que contiene glucosa, fructosa y sacarosa (si no se logra un 100 % de inversión), cuyo grado de inversión controla las propiedades funcionales del sirope final. Los azúcares o siropes invertidos, son edulcorantes de color pálidos elaborados por hidrólisis ácida o hidrólisis enzimática de una solución de azúcar refino. Estos contienen igual proporción de azúcares reductores: glucosa y fructosa. Estudios comparativos de dulzura realizados por autores como (Hannover and White, 1993); (Krause and Mahan, 1984), a pesar de existir diferencias en los valores estimados, coinciden en que la fructosa es el más dulce de todos los carbohidratos de origen natural, mientras que la glucosa posee un valor inferior al de la sacarosa. 1.2. Mecanismo cinético de las invertasas Varios modelos cinéticos se han propuesto para describir la hidrólisis de sacarosa en presencia de la enzima invertasa de levadura (𝛽-fructofuranosidasa). Todos los modelos propuestos se derivan de la ecuación de Michaelis - Menten, que luego sufre modificaciones en dependencia del grado de disolución, la viscosidad del medio en relación con la temperatura de trabajo o la inhibición producida por exceso de sustrato. La velocidad de estas reacciones presenta una dependencia característica de la concentración de sustrato, donde a bajas concentraciones la velocidad es proporcional a la concentración de la enzima sola (Martínez y Morales, 2007). El mecanismo de catálisis enzimática propuesto en la representación 1.1 para las invertasas coincide con el descrito por Michaelis – Menten para una reacción monosustrato de dos pasos (Bowski et al., 1971) k1 k2 E + S ES E + P k-1 (1.1) El sustrato S forma un complejo intermedio enzima-sustrato, donde la velocidad de reacción constituye la pendiente de la curva P o S en función del tiempo como se muestra en la figura 1.1. Las mediciones cinéticas se basan generalmente en la parte lineal de la curva, es decir, la velocidad o rapidez inicial de la reacción. En esta región, la concentración del producto es extremadamente pequeña y, en consecuencia, la descomposición de producto a sustrato es insignificante. Capítulo 1. Revisión bibliográfica 6 Figura 1.1. Cambio de la concentración del producto en función del tiempo (Scragg, 2002) La determinación de los cambios de la rapidez de la reacción como función de la concentración de enzima no es lineal, sino hiperbólica para una concentración dada de sustrato (figura 1.2). Lo anterior se debe a que todo el sustrato está en la forma de complejo enzima-sustrato (ES) a altas concentraciones de enzima. Como consecuencia de lo anterior, la velocidad inicial de la reacción como función de la concentración de enzima permanece constante en estas condiciones (Martínez y Morales, 2007) . Figura 1.2. Velocidad de reacción en función de la concentración de enzima (Scragg, 2002) Según el modelo cinético descrito para la sacarosa-invertasa de la levadura de Saccharomyces cerevisiae, propuesto en base a los resultados de mutagénesis dirigida (Reddy and Maley, 1996), la hidrólisis de la sacarosa sigue una cinética de doble desplazamiento. Esta hidrólisis, catalizada por la invertasa, se puede representar mediante el siguiente mecanismo de reacción: Capítulo 1. Revisión bibliográfica 7 Este es comparable al de la hidrólisis ácida, que se produce en el átomo de oxígeno glucosídico. Por lo tanto, podría ser sensible al plegamiento de la molécula de sacarosa a medida que su concentración es mayor. Los enlaces intramoleculares formados protegen el enlace glucosídico y evitan la inversión de la sacarosa (Combes and Monsan, 1983). La cinética de las invertasas es afectada por fenómenos de inhibición en soluciones concentradas de sacarosa. En tales condiciones, la inevertasa está sometida simultáneamente a la inhibición por D-fructosa, D-glucosa y sacarosa. La D-fructosa muestra el comportamiento de un inhibidor competitivo, lo cual es consistente con el mecanismo propuesto para la acción invertasa que implica a intermediarios covalentes D-fructosilo- enzima, mientras que la D-glucosa muestra inhibición no competitiva parcial. La disminuación de la actividad de la invertasa observada para concentraciones de sacarosa superiores a 0,4 M parece depender de la inhibición por exceso de sustrato y de la modificación de interacciones agua-sacarosa y sacarosa-sacarosa, que resultan en el plegamiento de la molécula de sacarosa por la formación de uno o dos puentes de hidrógeno intramoleculares formando agrupaciones de sacarosa (Combes and Monsan, 1983). 1.3. Métodos para la obtención de glucosa a partir de azúcar refino Para la producción de glucosa se emplea el azúcar refino C, por lo que la calidad y el rendimiento del producto obtenido dependen en gran medida de la calidad del refino insumido, que debe cumplir con la NC 377:2013 (Anexo 1.1). De igual forma, la calidad de refino producido depende de la del crudo que se procesa. De acuerdo a lo anterior, se han realizado propuestas e investigaciones en marcha, donde se valúa la factibilidad técnica- económica del proceso, sin la recirculación del jugo de los filtros en el proceso de producción de azúcar crudo. A nivel global una de las principales fuentes de obtención de glucosa es a partir del azúcar refino, al igual que el almidón de maíz como sustratos más utilizados; donde la inversión se logra a partir de la acción de un ácido a temperatura elevada, por intercambio iónico o por la presencia de la enzima invertasa (Díaz y col., 2020). 1.3.1. Hidrólisis ácida El proceso de inversión ácida de la sacarosa se lleva a cabo con una tecnología de origen nacional que opera en régimen discontinuo, propuesta por el Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar. Desarrolla la producción de glucosa Capítulo 1. Revisión bibliográfica 8 y sirope rico en fructosa a partir del azúcar refino, mediante la inversión ácida de la sacarosa (Díaz y col., 2020). Este método de hidrólisis tiene como inconveniente el empleo de un ácido (tales como clorhídrico, fosfórico, cítrico) a elevada temperatura (85-90 ℃), lo que puede originar productos coloreados con presencia de cenizas y subproductos no deseados (Albertini et al., 2012); (Duarte, 1997). La hidrólisis ocurre al incorporar una molécula de agua, lo que origina que el enlace glucosídico entre los dos monómeros que forman la sacarosa se hidrolicen, proceso que se lleva a cabo en un reactor discontinuo con agitación. Según (Kurup et al., 2005) y (Nasef et al., 2005) este método genera otros inconvenientes tales como: la obtención de un bajo porciento de inversión, alto consumo de la materia prima, color y sabor no característico del azúcar invertido, origina corrosión y la presencia de residuos ácidos en el producto final. 1.3.1.1. Revisión tecnológica y parámetros fundamentales del proceso de obtención de glucosa en la UEB Derivados Chiquitico Fabregat Dentro de las producciones de la UEB Chiquitico Fabregat se encuentra la obtención de glucosa y sirope rico en fructosa mediante un proceso tecnológico que cuenta con nueve etapas (Anexo 2): disolución-inversión, enfriamiento, primera cristalización, filtración, disolución de la torta, enfriamiento, segunda cristalización, centrifugación, envase y almacenamiento. El tanque utilizado para la disolución-inversión tiene geometría cilíndrica y se encuentra en posición horizontal. Este es agitado, con tres agitadores, al cual se alimentan 22,5 t de refino por cada hidrólisis para obtener una disolución de 77-78 °Brix, donde a su vez se alimenta vapor directo para elevar la temperatura hasta valores de 87-90 ℃. Para propiciar la inversión, a la disolución obtenida se alimentan 600 mL de ácido fosfórico al 85 % por cada tonelada de refino disuelta, que se mantiene en agitación por tres horas. Transcurrido este tiempo, el análisis experimental de la lectura sacarimétrica debe ser menor que -6 °S (MINAZ, 2005), obteniendo una disolución con valor de pH aproximado de 3. Con esta tecnología diseñada, la planta consume 6 t de refino por tonelada de glucosa y genera 6 t de jarabe de fructosa (MINAZ, 2005), lo que demuestra el alto índice de insumo de materia prima. Además, la posición del reactor es propicia para la generación de zonas muertas. La solución invertida se somete a enfriamiento por aire para disminuir la temperatura hasta valores inferiores de 35 ℃, proceso que puede durar hasta dos días. Esta solución es Capítulo 1. Revisión bibliográfica 9 alimentada a los cristalizadores, donde existe un pie de semilla y la alimentación de la recirculación del jarabe de glucosa obtenido en la centrifugación. Esta corriente de reciclo favorece la cristalización de la mayor parte de la glucosa existente, con un rendimiento en cristales de 22-25 %. La cristalización es un proceso que puede consumir hasta 21 días, debido en lo fundamental, a la dependencia del rendimiento en cristales del grado de enfriamiento alcanzado que se ve afectado por la carencia de un sistema de enfriamiento forzado (Rodríguez, 2016). La masa cristalizada pasa a un proceso de separación por un filtro de prensas verticales, donde se obtiene la glucosa cristalizada (80-82 °Brix) y el sirope de fructosa (75 °Brix). Este último es sometido a un proceso de refinación, cuyo producto ha de cumplir los requisitos establecidos de la NE 02: 2012 (Anexo 1.2) para su comercialización como materias primas de otras producciones. Sin embargo, se ha detectado la existencia de problemas mecánicos en el ajuste placa-marco (Ruíz, 2018). La glucosa obtenida sufre un proceso de disolución donde se alimenta vapor directo y agua, hasta obtener una concentración de 74-76 °Brix y temperatura de 80 ℃. De igual forma, la solución se somete a un proceso de enfriamiento por aire para disminuir la temperatura hasta 35 ℃. La glucosa atemperada es sometida a una segunda cristalización. Donde se ha de lograr con el agotamiento de las masas un rendimiento en cristales de 26 a 27 %, en un período de tiempo que abarca de 10-12 días. La centrifugación de la masa resultante ha de separar la glucosa cristalina con un 7-8 % de humedad, 89-90 % de pureza y los requisitos establecidos en la NE 01: 2012 (Anexo 1.3), del sirope de glucosa (71-73 °Brix) que es retornado a la primera cristalización. Las capacidades de centrifugación instaladas están limitadas, aspecto que ha de ser considerado en las proyecciones para un aumento de las producciones anuales. La glucosa cristalina es envasada en sacos de papel multicapa, que son enviados como materia prima para la producción de sorbitol. Este tiene como destino final su empleo como aditivo en las producciones que desarrolla la corporación Suchel S.A. (Díaz y col., 2020). Además, puede constituir una fuente importante para la producción de ácido glucónico y sus sales, que tiene gran utilidad en la medicina, industria farmacéutica y alimentaria (Ramachandran et al., 2006). Capítulo 1. Revisión bibliográfica 10 1.3.1.1.1. Consecuencias de las dificultades operacionales en el desarrollo del proceso Esta tecnología reporta bajos rendimientos de glucosa para un elevado consumo de azúcar refino. Valores que se ven desfavorecidos a su vez, por la existencia de zonas muertas en el reactor, lo que ocasiona dificultades para lograr la homogenización del medio y como consecuencia la inversión. Por otra parte, la operación con soluciones ácidas acelera los procesos corrosivos en el equipamiento instalado y la generación de productos ácidos que afectan la calidad de la glucosa obtenida. La carencia de un sistema de enfriamiento forzado hace que los periodos de duración de la cristalización se prolonguen y en muchas ocasiones no se logren los rendimientos en cristales esperados, parámetro que se refleja en el elevado porciento de glucosa disuelta en el sirope de fructosa y el sirope de glucosa que se recircula a la primera cristalización. Además, la existencia de problemas mecánicos en el filtro provoca que la glucosa cristalina obtenida se contamine con jarabe de fructosa, afectando el rendimiento, calidad y pureza del producto final. Por otra parte, las capacidades de centrifugación instaladas hacen que los tiempos consumidos para la producción diaria sean muy elevados e insuficientes para la proyección de un aumento de las capacidades de producción. Estas dificultades constituyen un inconveniente para los resultados satisfactorios en la operación e incluso si se consideran otras tecnologías de inversión, por lo que la búsqueda de alternativas que permitan solucionarlas o mejorarlas representa una prioridad. 1.3.2. Por intercambio iónico En este método se emplean resinas de intercambio iónico catiónicas fuertemente ácidas que contienen ácido sulfónico. El interior de este tipo de resina hinchada con agua, puede considerarse como una solución de ácido bastante concentrada. Estas resinas producirán reacciones catalizadas por ácidos tales como la inversión de la sacarosa. Esta propiedad puede utilizarse industrialmente como una alternativa de la catálisis mediante ácidos para invertir la sacarosa, evitando reacciones laterales no deseables mediante el empleo de un catalizador de intercambio iónico (Rodríguez, 2016); (Ruíz, 2018). 1.3.3. Empleo de la enzima invertasa En este método la disolución de sacarosa se pone en contacto con la enzima invertasa también denominada 𝛽-fructosidasa, definida como enzima que hidroliza la sacarosa en glucosa y fructosa. Capítulo 1. Revisión bibliográfica 11 (Cortés y col., 2020 b) en estudios para la hidrólisis de la sacarosa con la utilización de la enzima soluble determinaron una concentración de enzima óptima de 14,64 ml/ 100 grefino, lo que indica la necesidad de emplear 2899,87 l de enzima para hidrolizar un volumen de 21 m3 de solución de sacarosa (70 %) sin recuperación. Esta precisamente constituye la principal desventaja económica de este modo de empleo de la enzima. Existe una gran variedad de inevertasas que han sido utilizadas inmovilizadas para la obtención de licores invertidos, ya sea por inmovilización de la enzima o por inmovilización de microorganismos que expresen estas invertasas de forma natural. La invertasa de S. cerevisiae es la principal fuente de enzima para la producción industrial de azúcares invertidos, pero su actividad cae drásticamente cuando es utilizada a temperaturas superiores a 50 ℃ (Marquez et al., 2008); (Kotwal and Shankar, 2009); (Mahmoold, 2010) y sufre inhibición por sustrato a niveles de sacarosa superiores al 20 %. La enzima de Thermotoga maritima 𝛽-fructosidasa (BrfA) tiene una temperatura óptima de 90-95 ℃ (en ensayos de 10 min) y fue extremadamente insensible a la termoinactivación. Durante 5 h a temperaturas hasta 80 ℃ y pH 7, la enzima retuvo hasta el 85 % de su actividad inicial. De acuerdo a los resultados alcanzados en los diversos estudios, BfrA es la 𝛽- fructosidasa más termoesable descrita hasta la fecha (Liebl et al., 1998), y presenta una menor sensibilidad a la inhibición por sustrato que la invertasa de levadura comercial (Borges, 2017). Es por ello, que la BrfA recombinante constituye una candidata atractiva para la producción de azúcar invertido (Menéndez, et al., 2013); (Menéndez, et al., 2014). Esta enzima ha sido expresada en Pichia pastoris como una proteína glicosilada en residuos de aspargina. Estas glicosilaciones implicaron una variación en su talla que resultó entre 53-58 kDa. Sin embargo, esto no afectó ni las propiedades catalíticas, ni la especificidad de sustrato, ni el modo de acción de BfrA (Menéndez, et al., 2013). De acuerdo a los resultados anteriores y teniendo en cuenta que P. pastoris sea considerado un microorganismo GRAS (Generally Regarded as Safe) por la American Food and Drug Administration (FDA), o sea es considerado como seguro (Spohner et al., 2015), lo convierte en un candidato ideal para la expresión de invertasas para la obtención de azúcares invertidos con fines alimenticios. Distintos tipos de invertasas, a partir diferentes especies de plantas, han sido expresadas en P. pastoris para su caracterización molecular y funcional (Fu et al., 2003); (Nagaraj et al., 2005); (Cheng et al., 2009). Capítulo 1. Revisión bibliográfica 12 La utilización de las enzimas inmovilizadas, trae consigo una serie de ventajas como la reutilización continua del biocatalizador. Esta característica, junto con el uso de elevadas cantidades, conduce a un aumento de la productividad del fermentador (Arroyo,1998). Al encontrarse unida de forma rígida a un soporte por distintos tipos de enlace según la técnica de inmovilización, entre ellos por enlace covalente o atrapada en un gel, la enzima puede aumentar su termoestabilidad. Además, la fácil separación de las mezclas de reacción y la posibilidad de emplear una alta actividad enzimática por volumen del reactor, comparada con preparaciones de enzimas solubles, ha contribuido a que la biocatálisis mediante enzimas inmovilizadas haya sido objeto de estudio de diversos autores (Hanfeld et al., 2009). (Combes and Monsan, 1983) observaron la aplicación de la invertasa inmovilizada en la hidrólisis continua de sacarosa en soluciones concentradas, utilizando como soporte para la invertasa, la sémola o harina de maíz. Posteriormente (Godbole and D'Souza, 1990) utilizaron la invertasa inmovilizada mediante adsorción sobre fibras de algodón con polietilamina seguida de un acoplamiento con glutaraldehído para la hidrólisis de jarabes comerciales con sacarosa concentrada, donde el biocatalizador fue utilizado 30 veces en un reactor discontinuo durante 50 días sin pérdida de actividad de la invertasa. (Gómez, 2015) llevó a cabo un estudio acerca de la estabilización funcional y operacional de las enzimas hidrolíticas de interés industrial, entre ellas, la invertasa. Se realiza la síntesis y caracterización del complejo invertasa- quitosana (INV-QSA). Este complejo se inmoviliza en soportes sintetizados, entre ellos, el Quitina-carboximetilcelulasa de sodio (Quit-CMC). Sin embargo, el empleo de biocatalizadores inmovilizados, puede presentar inconvenientes. La actividad enzimática se puede ver afectada por las condiciones en que se lleve a cabo la inmovilización y el entorno que rodea la enzima, diferente del habitual. Por otra parte, la velocidad de difusión de sustratos y productos dentro del sistema de biocatalizadores, puede limitar su actividad y eficiencia si dicha velocidad es menor que la velocidad de transformación que está llevando a cabo. Por otra parte, desde el punto de vista económico la inmovilización implica una nueva etapa en el proceso, aumentado la complejidad y costo del mismo, lo que deberá ser compensado con aumentos de productividad y tiempos de operación más largos (Carvalho, 2011). La invertasa de T. maritima ha sido utilizada en la producción de licores fructosados, inmovilizada en glioxil sepharosa (Martínez et al., 2014 a). La enzima intracelular de la Capítulo 1. Revisión bibliográfica 13 levadura recombinante P. partoris GS115 BfrA4X ha sido empleada, en este caso por inmovilización de la cepa inactivada en alginato de calcio (Martínez et al., 2014 b). Estos biocatalizadores han sido empleados tanto en reactores discontinuos tipo tanque agitado, como en columnas de lecho fijo (Menéndez, et al., 2014). Una alternativa al empleo de enzimas inmovilizadas, es el empleo de enzimas libres en reactores de membranas, las cuales permiten recircular la enzima dentro del reactor, mientras el producto de hidrólisis es recuperado a través de una membrana (Tomotani and Vitolo, 2007). Los reactores de membrana constituyen un intento de integrar la conversión catalítica, la separación de productos y/o concentración, y el recobrado del catalizador en una operación simple; requiriendo de enzimas libres y con un grado de pureza que permita operar sin afectar la integridad de las membranas (Prazeres and Cabral, 1994). Generalmente los esfuerzos experimentales reportados en los estudios anteriores se basan en la obtención de un biocatalizador adecuado con el cuál se cumplan los requisitos de rendimiento y calidad en la producción de siropes invertidos sin embargo, la relación de los factores experimentales que más influencia tienen sobre los valores de inversión en el propio sistema de reacción con vista a su aplicación a escala industrial no son optimizados. Una propuesta eficaz para la optimización de procesos de esta índole es llevar a cabo su estudio a partir de diseños de experimentos y Métodos de Superficie de Respuesta (MSR), permitiendo obtener los niveles óptimos en las variables de control que producen los valores de respuestas máximas (o mínimas) en ciertas regiones de interés, o buscar una solución de compromiso que mejore la calidad del producto o servicio (Gutiérrez y De la Vara, 2008). En las etapas iniciales de estos procesos investigativos; cuando aún no se tienen modelos cinéticos, difusionales, u otros, de naturaleza fenomenológica que permitan establecer de forma precisa los mejores comportamientos operacionales, estos métodos tienen una gran aplicabilidad. Estos son flexibles y ofrecen la posibilidad de la toma de decisiones sobre parámetros técnicos y económicos. 1.4. La Metodología de Superficie de Respuesta para la optimización experimental La Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) es un conjunto de técnicas matemáticas utilizadas para la determinación de una respuesta de interés, que está influenciada por varios factores de carácter cuantitativo (Sánchez, 2011). Permite realizar desplazamientos de la Capítulo 1. Revisión bibliográfica 14 región experimental en una dirección adecuada o detallar la región experimental inicial (Gutiérrez y De la Vara, 2008). La relación entre la respuesta y los factores o variables de entrada, puede ser representada por el modelo considerado por (Sánchez, 2011), que plantea: 𝑦 = 𝑓(𝑋1, 𝑋2, … , 𝑋𝐾) + 𝜀 (1.2) donde la forma de la función de respuesta real 𝑓 es desconocida y 𝜀 es un error que representa las fuentes de variabilidad no capturadas por 𝑓; aunque en el análisis de regresión es conveniente convertir las 𝑋 en variables codificadas 𝑥1, 𝑥2, … , 𝑥𝑘 (Fernández y Piñeiro, 2009) De modo general, (Hernández, 2007) asume que los factores de entrada están en forma codificada expresados como sigue: 𝑦 = 𝑓(𝑥1, 𝑥2, … , 𝑥𝐾) + 𝜀 (1.3) Sobre esta base, el estudio de la relación entre la respuesta 𝑦 y las 𝑥𝑖, dada en las ecuaciones (1.2) y (1.3) está sustentado en el MSR, permitiendo realizar un bosquejo gráfico con el propósito de maximizar o minimizar la respuesta, o alcanzar un valor deseado de la misma. Debido a que 𝑓 es desconocida y posee error aleatorio, se necesita correr experimentos para obtener datos acerca del comportamiento de 𝑦. El éxito de la investigación depende, dada una buena conducción experimental, en qué tan bien 𝑓 puede ser aproximada (Myers et al., 2009). Es importante resaltar que el MSR es una técnica secuencial. Frecuentemente, la estimación inicial de las condiciones óptimas de operación está alejada del óptimo real, así que el objetivo es, usando el método más simple y menos costoso posible, moverse rápidamente hacia las cercanías del óptimo (Acosta y col., 2021). Sobre esta base (Martínez, 2010) elabora un procedimiento secuencial para la determinación de la superficie respuesta. (Gutiérrez y De la Vara, 2008) destacan que los polinomios más frecuentemente usados como funciones de aproximación son los de órdenes uno y dos, que proporcionan los modelos lineales y cuadráticos. 1.4.1. Modelo de segundo orden Este tipo de aproximación es útil cuando existe curvatura en la superficie de respuesta, ya que el modelo de primer orden resulta ser una aproximación inadecuada, por lo que es necesario buscar un modelo que se ajuste mejor a los datos experimentales (Myers et al., Capítulo 1. Revisión bibliográfica 15 2009). Una representación de la superficie respuesta para un polinomio de segundo orden, es obtenida en estudios realizados por (Fernández y Piñeiro, 2009), quienes evalúan la eficiencia de una reacción (𝑦) que depende simultáneamente de la temperatura y el tiempo. El modelo de segundo orden considerado por (Cornell, 1990) tiene la forma: 𝑦 = 𝛽0 + ∑ 𝛽𝑖 𝑘 𝑖=1 𝑥𝑖 + ∑ 𝛽𝑖𝑖 𝑘 𝑖=1 𝑥𝑖 2 + ∑ ∑ 𝛽𝑖𝑗 𝑘 𝑗=2 𝑗>𝑖 𝑘−1 𝑖=1 𝑥𝑖𝑥𝑗 + 𝜀 (1.4) En éste los βi son los coeficientes de regresión para los términos de primer orden, los βii son los coeficientes para los términos cuadráticos puros, los βij son los coeficientes para los términos de producto cruz y 𝜀 es el término del error aleatorio, siendo los dos últimos de segundo orden. Los parámetros del modelo se estiman mediante el método de mínimos cuadrados. Una vez que se tienen los estimadores se sustituyen en la ecuación, obteniéndose el modelo ajustado en el vecindario del valor óptimo de la respuesta (Cornell, 1990): ŷ = 𝑏0 + ∑ 𝑏𝑖 𝑘 𝑖=1 𝑥𝑖 + ∑ 𝑏𝑖𝑖 𝑘 𝑖=1 𝑥𝑖 2 + ∑ 𝑏 𝑘−1 𝑖=1 𝑥𝑖𝑥𝑗 + 𝜀 (1.5) Se ha de verificar que el modelo tiene suficiencia de ajuste y que los coeficientes son significativos, para la aplicación de las técnicas de optimización correspondientes. 1.4.2. Diseños de segundo orden para ajustar superficies de respuesta Los diseños para ajustar un modelo de segundo orden y su expresión ajustada dados en las ecuaciones (1.4) y (1.5), se emplean cuando se quiere explorar una región que se espera que sea más compleja o cuando se cree que el punto óptimo ya se encuentra dentro de la región experimental (Gutiérrez y De la Vara, 2008). El diseño seleccionado para el ajuste debe tener al menos tres niveles de cada factor (-1, 0, +1) (Nóchez y Ventura, 2009). Es deseable que sean ortogonales como es el caso del diseño 3𝑘 descrito por (Ruíz y col., 2017). Sin embargo, este diseño requiere de un gran número de corridas experimentales y, por tanto, los más utilizados tienen la propiedad de ser rotables (Gutiérrez y De la Vara, 2008). Se dice que un diseño es rotable cuando la varianza de la respuesta predicha en algún punto es función sólo de la distancia del punto al centro y no es una función de la dirección (Nóchez y Ventura, 2009), donde estos autores a su vez, refieren la importancia de esta propiedad para la optimización. Los diseños de segundo orden más recomendados y, por tanto, más utilizados, Capítulo 1. Revisión bibliográfica 16 son el diseño de Box-Behnken y el diseño central compuesto (Gutiérrez y De la Vara, 2008). Los diseños compuestos centrales (DCC) se presentan como una alternativa a los diseños factoriales 3k (Ruíz y col., 2017) que fue introducida por Box y Wilson (1951). Es el más utilizado en la etapa de búsqueda de segundo orden debido a su gran flexibilidad: se puede construir a partir de un diseño 2𝑘 o 2𝑘−𝑝(Gutiérrez y De la Vara, 2008), con 𝑛𝑜 ≥ 0 puntos centrales y 2𝑘 puntos axiales de forma que el número total de puntos del diseño sea 𝑁 = 3𝑘 + 2𝑘 + 𝑛𝑜 (Nóchez y Ventura, 2009); (Ruíz y col., 2017). Con el mismo propósito Box y Behnken (1960) desarrollaron diseños factoriales de tres niveles para ajustar superficies de respuesta. Estos están formados por la combinación de diseños factoriales a dos niveles con diseños de bloque incompleto balanceado (DBIB) en una manera particular (Hernández, 2007). Se distinguen por no incluir como tratamiento a los vértices de la región experimental (Gutiérrez y De la Vara, 2008). Además, suelen ser muy eficientes en cuanto al número de corridas (Hernández, 2007), por lo que al igual que los DCC es ampliamente utilizado. 1.5. Escalado de reactores agitados Los reactores agitados son utilizados con frecuencia en los estudios de inversión de la sacarosa a partir de biocatalizadores inmovilizados (Mahmoold, 2010); (Awad et al., 2013), aunque en su mayoría son estudios a escala de laboratorio, no es común encontrar reportes sobre el escalado de estos procesos. El escalado de reacciones en vasos agitados consiste en seleccionar las variables de mezclado para conseguir el rendimiento deseado tanto en la escala piloto como en la gran escala. Esto es a menudo una tarea difícil, a veces incluso imposible, usando similitud geométrica, por lo que el uso de impulsores no geométricos en la planta piloto comparados con los impulsores utilizados a escala industrial, a menudo permite una modelación más cercana a los requisitos de mezclado que deben alcanzarse (Perry and Green, 1999). Para las operaciones de mezclado, el criterio de escalado se da habitualmente como una ecuación general (Montante et al., 2003): 𝑁𝐷𝑛 𝑖= constante. Donde 𝑁 es la velocidad de rotación y 𝐷𝑖 es el diámetro del impulsor. El exponente (𝑛) depende de las características específicas del proceso. En reactores de suspensión agitados, este tipo de criterio de escalado es frecuentemente derivado de estudios relativos a la mínima velocidad rotacional para la suspensión total de los sólidos. Capítulo 1. Revisión bibliográfica 17 Los valores de 𝑛 derivados de diversos estudios sobre la calidad de la distribución de los sólidos se encuentran entre 0,67 (turbina de simple hoja inclinada) y 0,93 (turbina de múltiples hojas inclinadas y turbinas Rushton múltiples) (Montante et al., 2003). La ecuación general para el movimiento de fluido en un sistema de mezcla no contiene menos de 13 términos. De estos términos, 9 definen las condiciones geométricas. Si estos se pueden fijar, y se respeta la similitud geométrica de forma estricta, la ecuación se puede simplificar y escribir como 𝑁𝑝 = 𝐶𝑅𝑒𝑚𝐹𝑟𝑛, donde 𝑁𝑝 es el número de potencia, 𝑅𝑒 es el número de Reynolds, 𝐹𝑟 es el número de Froude y 𝐶 es el factor de forma. La gran mayoría de las operaciones de mezclado pueden ser manejadas por esta ecuación. Es importante destacar que el número de potencia para un sistema particular es independiente del tamaño del vaso. Esta es la razón por la cual los experimentos en modelos muy pequeños pueden ser utilizados para determinar las características de potencia de los sistemas de mezclado en la planta a gran escala. Generalmente, la suspensión de sólidos en vasos a gran escala se mantiene por velocidades de agitación inferiores en comparación con los vasos pequeños, si se aplica la similitud geométrica. También pueden aparecer grandes diferencias en relación con los requerimientos de potencia entre la pequeña y la gran escala, debido a que la potencia por unidad de volumen 𝑃 varía con 𝑁3𝐷𝑖2 de acuerdo con la ecuación de Zwietering (McCabe et al., 1983). Si se obtiene una satisfactoria suspensión de sólidos en un tanque pequeño, la cual puede corroborarse por inspección visual, velocidad de las partículas, o la velocidad de transferencia de masa, un criterio seguro para el escalado es mantener la similitud geométrica y potencia por unidad de volumen constante. A menudo se recomiendan las relaciones 𝐷𝑖/𝐷= 1/3 y 𝑍𝑖/𝐷= 0,25 (McCabe et al., 1983). Los números de Reynolds en tanque grandes serán más elevados, típicamente del orden de 5 a 25 veces más altos, que los tanques pequeños. Para una entrada de potencia específica, debe prestarse mucha atención a la relación 𝐷𝑖/𝐷 durante el escalado. Esta relación depende en gran medida de la naturaleza de la agitación y puede tomar los siguientes valores óptimos: ▪ 0,25 para dispersar un gas en un líquido. ▪ 0,40 para el contacto de dos fluidos inmiscibles. ▪ 0,60 o más para algunas operaciones de mezclado. Capítulo 1. Revisión bibliográfica 18 Al mantener la entrada de potencia estable en una operación específica, la velocidad del impulsor es inversamente proporcional al tamaño del impulsor. En general, las operaciones que dependen de grandes gradientes de velocidad, se logran satisfactoriamente con impulsores pequeños; mientras que los impulsores grandes, de movimiento lento, se deben utilizar preferiblemente para las operaciones que dependen de altas tasas de circulación (McCabe et al., 1983). 1.6. Intercambiadores de calor Un intercambiador de calor es el dispositivo encargado de mantener la transferencia de energía térmica interna entre dos o más fluidos, entre una superficie sólida y un fluido, o entre partículas sólidas y un fluido, en contacto térmico sin calentamiento externo e interacciones de trabajo. El diseño básico de un intercambiador de calor normalmente tiene dos fluidos de temperaturas diferentes separados por algún medio conductor, o sea, un fluido que fluye a través de los tubos de metal y el otro que fluye alrededor de los tubos. De esta forma, en cualquier lateral del tubo el calor se transfiere por convección, mientras que por la pared la trasferencia ocurre por conducción (Mustelier, 2005). Además, se encuentran un gran número de sistemas de intercambio, donde la transferencia de calor se produce por medio de una mezcla física de los fluidos que intervienen en el proceso como es el caso de las torres de refrigeración (Ruíz, 2018). Estos de forma general, constituyen los equipos básicos para el funcionamiento de cualquier instalación energética, siendo a su vez un factor clave para el mejoramiento de la eficiencia de estas instalaciones y la disminución del consumo de energía. 1.6.1. Intercambiadores de calor de tubos y coraza Estos son los más ampliamente utilizados en la industria química y con las consideraciones de diseño mejor definidas, a partir de los cuales se obtienen grandes superficies de transferencia de calor. Consisten en una estructura de tubos colocados en el interior de un casco de mayor diámetro, que presentan comúnmente arreglo en cuadrado, triangular, en cuadrado rotado o triangular con espacios para limpieza (Kern, 2005). Por otra parte, los deflectores ubicados en la región anular entre los tubos y la coraza, inducen cierto grado de turbulencia en el fluido que fluye por esta región, permitiendo que se logren coeficientes de transferencia de calor más alto, en dependencia del espaciado de los mismos. Esta turbulencia puede generar a su vez una mayor caída de presión del fluido al lado de la Capítulo 1. Revisión bibliográfica 19 coraza, y en dependencia de los requerimientos del proceso, en muchas ocasiones será necesario llegar a un compromiso. A partir del análisis de los parámetros operacionales y criterios establecidos en la literatura se estableció una metodología de diseño que se representa en la Figura 1.3. Inicio Balance de energía Cálculo de los valores corregidos de la diferencia media de temperatura Propuesta del coeficiente total de diseño (UD) dentro del rango establecido Cálculo del área de transferencia de calor Selección de la configuración de los tubos y especificaciones del equipo intercambiador Determinación de la temperatura de evaluación de las propiedades y ubicación de los fluidos Cálculo de los coeficientes individuales, los coeficientes totales y los factores de obstrucción (Rd) Rdreq ≤ Rdcal Si No Determinación de la caída de presión (∆P) ∆P ≤ ∆Padmisible Si Análisis de resultados Fin No Cambio en el número total de pasos Determinación de la superficie de intercambio en exceso % Exceso requerido Si No Cambio en el número de tubos y diámetro de la coraza Figura 1.3. Metodología propuesta para el diseño de intercambiadores de calor de tubos y coraza Para el diseño de este tipo de intercambiador es necesario verificar que el coeficiente total de diseño incluya a los factores de obstrucción correspondientes a las sustancias de trabajo garantizando el adecuado funcionamiento del mismo, además de que la superficie de intercambio cumpla con los requerimientos del proceso (Kern, 2005). A su vez, se ha de comprobar que las caídas de presión no excedan los valores admisibles, de forma tal que el Capítulo 1. Revisión bibliográfica 20 sistema no aporte una carga excesiva para el transporte de los fluidos (Mijeev, 1979); (Pávlov y col., 1981) como se muestra en la metodología presentada en la figura 1.4. 1.6.2. Evaporadores La evaporación se produce cuando por efecto de la temperatura, la energía cinética de las moléculas de un líquido aumenta, lo que les permite liberarse de la atracción de las moléculas vecinas y pueden desprenderse de la solución (Ruíz, 2018). El objetivo de esta operación es concentrar una solución que consta de un soluto no volátil y un disolvente volátil, y se lleva a cabo vaporizando una parte del disolvente con el fin de obtener una solución concentrada (Ulrich, 1990). En la obtención de jarabes glucosados, una vez realizada la inversión enzimática, es necesario llevar a cabo un proceso de concentración con el fin de preservar y facilitar el transporte y almacenamiento del jarabe. Durante esta etapa se elimina agua de la solución líquida por medio de la adición de calor hasta alcanzar su temperatura de ebullición, obteniéndose un producto concentrado con mayor estabilidad y vida útil. Existen dos formas de llevar a cabo esta operación: a simple efecto donde se utiliza un solo evaporador o a múltiple efecto con una serie de evaporadores conectados en serie. La característica principal del múltiple efecto consiste en que el vapor procedente del líquido en ebullición del primero se emplea como vapor de calefacción del segundo, y así para el número de evaporadores instalados. Siendo el primer evaporador el que recibe el vapor vivo procedente de un generador de vapor, disminuyendo el consumo de vapor (Ulrich, 1990). 1.6.2.1. Principios de Rillieux Estos fundamentos fueron planteados en 1840 y han tenido un impacto significativo en la industria azucarera y de procesos. A partir de investigaciones en estas propias industrias, Rillieux desarrolló reglas generales o principios para el diseño y funcionamiento de los evaporadores, tales como las refiere (Mazariegos, 2014): a) En un evaporador múltiple efecto con n efectos, un kg de vapor evaporará n kg de agua. b) Cuando se efectúa extracciones de vapor desde el i-enésimo efecto de un tren evaporador múltiple efecto de n efectos, para ser utilizada en reemplazo de escape en otra aplicación distinta de los evaporadores, el ahorro de vapor será i/n veces la cantidad de vapor utilizada para esta tarea. Capítulo 1. Revisión bibliográfica 21 c) En todo lugar donde se condense vapor u ocurran extracciones de vapor, se deben efectuar arreglos que permitan liberar continuamente los gases incondensables. 1.6.2.2. Evaporadores de tubos cortos verticales Este tipo de evaporadores, también conocidos como evaporadores Robert, están formados por un cuerpo cilíndrico con tubos verticales contenidos entre dos placas horizontales que se extienden transversalmente por el cuerpo. La parte inferior, donde se encuentran los tubos, se conoce como calandria (Tower and Sinnott, 2013), cuya longitud usualmente no supera a los 6 pies de altura y es por donde el vapor fluye. Poseen un gran paso circular de derrame en el centro del haz de tubos donde el líquido más frío recircula hacia la parte inferior de los mismos. El área de este derrame varía desde la mitad del área de los tubos hasta un área igual a ella, los cuales poseen un diámetro exterior de hasta 3 plg, que favorecen la circulación sin una excesiva caída de presión (Kern, 2005). 1.6.2.3. Diseño y evaluación de un múltiple efecto evaporador Para el diseño de evaporadores de múltiple efecto para soluciones azucaradas, es conveniente basarse en los criterios establecidos por autores como (Hugot, 1974) y (Rein, 2012), dada su experiencia en procesos de esta índole, refiriendo su evaluación a los valores prácticos establecidos para los distintos parámetros. Inicio Distribución de presión y temperatura Selección del coeficiente de evaporación Determinación de la evaporación total y el área total Determinación de la concentración y los flujos intermadios Determinación y evaluación del coeficiente global de transferencia de calor teórico Cálculo del calor transferido Evaluación del sistema y comparación con resultados teóricos Existe correspondencia Corrección del coeficiente global de transferencia de calor Si No Búsqueda de alternativas sobre los parámetros operacionales Fin Figura 1.4. Metodología propuesta para el diseño del sistema de evaporación Capítulo 1. Revisión bibliográfica 22 Varios autores como (Kern, 2005) establecen las bases para la realización del diseño. Teniendo en cuenta los parámetros establecidos por estos autores y los valores prácticos que se reportan industrialmente, se desarrolló la estrategia de diseño representada en la Figura 1.4. Conociendo la información mínima necesaria como: las presiones de operación, las temperaturas de trabajo, las concentraciones, las áreas de transferencia de calor y los flujos que se manejan, es posible determinar los parámetros fundamentales para su evaluación (Mustelier, 2005). La economía definida como la relación entre la evaporación total y el consumo de vapor ha de ser consecuente con los valores reportados en la tabla 1.1, lo que indica que el vapor consumido es aprovechado casi en su totalidad para la operación de evaporación. Tabla 1.1. Valores teóricos y prácticos de la economía para múltiples efectos Equipo Valores teóricos Valores prácticos Simple efecto 1 0,95 Doble efecto 2 1,90 Triple efecto 3 2,85 Cuádruple efecto 4 3,90 Quíntuple efecto 5 4,80 Fuente: (Espinosa, 1991) Por otro lado, el coeficiente de evaporación, definido como la relación entre la evaporación total y el área total de transferencia de calor demuestra la eficiencia del uso del área. Otro parámetro base del diseño es el coeficiente total de transferencia de calor, que se ha de comparar con los valores teóricos reportados (tabla 1.2) por autores como (Hugot, 1974); (Espinosa, 1991). Tabla 1.2. Coeficientes totales de transferencia de calor para múltiples efectos en W/m2℃ Efecto Triple Cuádruple Quíntuple 1 2 100 2 000 2 000 2 1 450 1 400 1 400 3 650 950 1 000 4 - 450 725 5 - - 425 Fuente: (Hugot, 1974) La relación de la cantidad de vapor al condensador y la producida en los evaporadores, conocida como eficiencia del área de evaporación, constituye otro aspecto a evaluar, ya que permite conocer si se usa intensivamente el vapor producido en el múltiple efecto. Capítulo 1. Revisión bibliográfica 23 1.7. Conclusiones Parciales 1. La inversión enzimática de la sacarosa constituye una alternativa superior a la hidrólisis ácida al reportar mayores beneficios económicos en cuanto a rendimiento y calidad, menores impactos ambientales por la sustitución de sustancias agresivas y un menor consumo energético asociado al manejo de soluciones menos concentradas. 2. La utilización de las enzimas inmovilizadas con buenas propiedades para su reúso, reporta importantes ventajas respecto a la utilización de la invertasa sumergida. 3. El método de inversión ácida de la sacarosa llevado a cabo en Chiquitico Fabregat unido con deficiencias tecnológicas en las etapas de cristalización y filtración generan insuficiencias en sus producciones, por lo que se hace necesario el desarrollo y evaluación de nuevas tecnologías. 4. Se han reportado resultados satisfactorios con la utilización de biocatalizadores de enzima invertasa inmovilizada, sin embargo la relación de los factores experimentales que más influencia tienen sobre los valores de inversión en condiciones reactivas con vista a su aplicación a escala industrial, no han sido optimizados. 5. Una propuesta eficaz para la optimización de procesos de esta índole es llevar a cabo su estudio a partir de diseños de experimentos y MSR. Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 24 CAPÍTULO 2. PROPUESTA METODOLÓGICA PARA LA CONDUCCIÓN EXPERIMENTAL Y OPTIMIZACIÓN DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA SACAROSA 2.1. Selección de un biocatalizador adecuado para la hidrólisis del azúcar refino Para la selección de un sistema de reacción adecuado para la hidrólisis de la sacarosa a partir de la enzima invertasa inmovilizada, se analizaron las alternativas propuestas por diversos autores expuestas en el epígrafe 1.4.3, entre las cuales se consideraron fundamentalmente: (Combes and Monsan, 1983) con el empleo de un sistema continuo de reacción utilizando como biocatalizador la invertasa inmovilizada sobre harina de maíz; (Gómez, 2015) con el empleo de un reactor de lecho empacado a partir del complejo invertasa-quitosana (INV- QSA) inmovilizado en soportes sintetizados, entre ellos, el Quitina-carboximetilcelulasa de sodio (Quit-CMC); y (Menéndez y col., 2014) con el desarrollo de catalizadores termoestables basados en la invertasa de T. maritima y su utilización en reactores de lecho empacado y discontinuos. A nivel comercial la producción de siropes invertidos se realiza a partir de la hidrólisis enzimática del azúcar de caña o remolacha a partir de la invertasa de S. cerevisiae, sea en forma de crudo enzimático, enzima inmovilizada o célula inmovilizada; sin embargo esta enzima es termolábil. Particularmente la termoestabiliadad es una propiedad operacional deseada en las enzimas destinadas a la industria azucarera, debido a que su expresión como catalizador inmovilizado mantienen estabilidad al trabajar a temperaturas comprendidas entre 60 ℃-70 ℃, permitiendo el reúso del biocatalizador en la hidrólisis de soluciones concentradas de sacarosa, por lo que sobre estos criterios fue encaminada la selección de un biocatalizador adecuado. Existen reportes que datan del año 1992 de estudios llevados a cabo por investigadores del CIGB de Sancti Spíritus, encaminados a la investigación de biocatalizadores inmovilizados con alta actividad de sacarosa invertasa recombinante, que aportaron importantes avances a la biotecnología de producción de sirope invertido glucosa fructosa. Los biocatalizadores se basaron en células vivas a partir de células inmovilizadas en alginato de calcio de las levaduras Hansenula polymorpha y P. pastoris que acumulaban en el espacio periplasmático la invertasa (Suc2) de S. cerevisiae. A pesar de la novedad científica aportada, estos biocatalizadores presentaron inconvenientes operacionales que impidieron su Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 25 implementación a escala industrial. El uso de un sistema de inducción por metanol para la expresión del gen Suc2 en ambas levaduras hospederas constituye un impedimento económico y riesgoso cuando se operan volúmenes elevados. Por otro lado, ambos biocatalizadores utilizaban células de levaduras recombinantes vivas, lo que constituye un riesgo ambiental, unido a la liberación de CO2 que desfavorece su capacidad de reúso. Además la invertasa de S. cerevisiae se inactiva a temperaturas superiores a 45 ℃-50 ℃, lo que desde el punto de vista práctico interfiere en la hidrólisis de soluciones concentradas de sacarosa por problemas de difusión del sustrato en el interior del biocatalizador y contaminación microbiana, condiciones que desfavorecen la conversión del azúcar refino. Particularmente (Menéndez y col., 2014), teniendo en cuenta los inconvenientes anteriores, realizan estudios para la obtención de biocatalizadores termoestables y su utilización en la hidrólisis de la sacarosa. En su línea de investigación, múltiples copias del gen codificante para la 𝛽-fructosidasa (BfrA) de T. maritima fueron insertados en el genoma de la levadura hospedera P. pastoris para su expresión constitutiva, lo que les permitió la inmovilización de las células de la levadura recombinante en las perlas de alginato de calcio (biocatalizador PpABfrA) o de la enzima libre sobre un soporte sólido adecuado (biocatalizador GSBfrA). Estos biocatalizadores resultaron ser superiores desde el punto de vista operacional, respecto a los biocatalizadores anteriores al reportar importantes ventajas. Para la expresión del gen BfrA utilizaron azúcar de caña, eliminando el empleo del metanol. En este caso el rango de temperatura óptima de 60 ℃ -70 ℃ donde las levaduras no son viables, garantiza la seguridad ambintal y su utilización en sistemas continuos, manteniendo la actividad enzimática intacta con buenas posibilidades para su reúso. Esta propiedad operacional derivada de la termoestabilidad, a su vez eleva la eficiencia del proceso industrial, al hidrolizar soluciones de sacarosa más concentradas y evitar la contaminación microbiana, con reportes de un 100 % de conversión de sacarosa en azúcares reductores. De acuerdo a los resultados obtenidos por (Martínez et al., 2014 a) el biocatalizador GSBfrA a escala de laboratorio realizó la inversión completa del azúcar de caña (70 %) a las 9 h en un reactor de tanque agitado. La vida media de la enzima inmovilizada fue de 5 días en un reactor de columna de lecho fijo operando continuamente. Particularmente, cabe destacar, que los sistemas discontinuos de reacción permiten ejercer un mayor control de las variables operacionales, por lo que en procesos de esta índole, se obtienen resultados muy Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 26 satisfactorios. Por otro lado, el biocatalizador PpABfrA presentó una vida media de reúso en 15 reacciones discontinuas de 24 horas operando en un reactor discontinuo sobre 70% de azúcar de caña. Unido a estas características operacionales cabe destacar que las ventajas de utilizar geles de naturaleza biológica como soporte, en este caso alginato, están dadas por la pequeña posibilidad de sufrir daños debido a que las reacciones de polimerización son muy suaves y a su vez, sus propiedades no tóxicas les permite ser empleados en producciones cuyo destino sea la industria alimentaria o farmacéutica. Por tanto, de acuerdo a los criterios plantados con anterioridad, se tuvo en cuenta para la propuesta de la conducción experimental para estudios futuros y el establecimiento de las condiciones de reacción para el proceso de hidrólisis de la sacarosa en la UEB Chiquitico Fabregat, el biocatalizador PpABfrA. Estudios realizados por (Martínez, 2015) con este biocatalizador arrojaron resultados satisfactorios para la hidrólisis a una temperatura de trabajo de 60 ℃, una concentración de sustrato de 1,75 M y una relación de alimentación al biorreactor de 1:10 gbiocatalizador/mlsolución. El estudio se llevó a cabo para varias concentraciones de sustrato, mientras que la concentración de enzima a su vez fue evaluada para una relación de 1:5. A pesar del elevado porciento de hidrólisis que se alcanzan en dichas condiciones en un período de 12 h y la estabilidad reportada por el biocatalizador para su reúso, la investigación presenta limitaciones al no considerar la temperatura como variable optimizable en condiciones reactivas. Valores superiores de temperatura de acuerdo a la termoestabilidad del biocatalizador podrían reportar resultados satisfactorios en la operación de hidrólisis para soluciones de sacarosas más concentradas o, por otro lado, disminuir el tiempo de reacción para igual concentración en la solución alimentada. Particularmente, los procesos difusiones y de interacción enzima-sustrato se ven favorecidos a elevadas temperaturas dada la viscosidad del medio y, por otro lado, al operar con soluciones más concentradas se favorecen las posteriores etapas de cristalización del proceso de obtención de glucosa. A su vez variaciones en la concentración de enzima en el reactor pudieran reportar cambios en las velocidades de reacción y aportar resultados novedosos para la investigación. Por lo que una metodología adecuada para la optimización, que permita evaluar la influencia de estos parámetros operacionales en los rendimientos y la toma de decisiones sobre los valores más convenientes desde el punto de vista técnico-económico para el desarrollo del proceso, Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 27 necesita ser implementada. Este estudio no puede descuidar el principal objetivo de la utilización de los biocatalizadores termoestables: su posibilidad de reúso, por lo que la estabilidad del mismo debe ser evaluada para un tiempo de reúso que reporte resultados económicamente atractivos. Estas perspectivas y criterios metodológicos se desarrollan como sigue. 2.2. Propuesta metodológica para la optimización experimental mediante la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) Para el establecimiento de las condiciones operacionales óptimas, se han de tener en cuenta una serie de criterios y decisiones, basados en los fundamentos teóricos y las experiencias experimentales. A su vez, se han de identificar las variables que mayor influencia tienen sobre la respuesta evaluada, teniendo en cuenta el problema de optimización previamente definido. Esta tarea, en muchas ocasiones, resulta un tanto difícil y engorrosa, si no se tiene en cuenta un procedimiento bien establecido, que asegure la veracidad de los resultados. Teniendo en cuenta los criterios establecidos en el epígrafe 1.5, el MSR constituye un procedimiento viable para la optimización. El enfoque de esta metodología es heurístico y sigue la secuencia de acciones presentadas por (Acosta y col., 2021), combinadas con decisiones y procedimientos que permiten cumplir los objetivos propuestos, obteniendo resultados altamente confiables y con el menor esfuerzo experimental. La optimización de las condiciones de reacción de un determinado proceso, ha sido objeto de estudio de diversos autores como (Fernández y Piñeiro, 2009); (Chirinosa y col., 2017). En este caso, el objetivo es hallar los valores óptimos de las variables operacionales para la reacción de hidrólisis de la sacarosa mediante el biocatalizador PpABfrA. Los factores experimentales seleccionados para la evaluación de un proceso de esta índole están directamente vinculados a la obtención de un mayor porciento de inversión en el menor tiempo posible, como variables respuestas. De acuerdo a los estudios realizados por (Gómez, 2015) y (Martínez et al., 2014 b) sobre la utilización de biocatalizadores inmovilizados en la hidrólisis de la sacarosa y los criterios establecidos en el epígrafe 2.1, las variables independientes seleccionadas para el establecimiento del procedimiento de optimización fueron: la concentración de sacarosa, la temperatura y la relación de alimentación (g de biocatalizador/ ml de solución) del biorreactor. Teniendo en cuenta las características del Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 28 proceso y las bases para la optimización propuestas por (Acosta y col., 2021) se desarrolló la metodología que se representa en la Figura 2.1 con carácter secuencial e investigativo. (Martínez, 2015) en el estudio del biocatalizador PpABfrA determinó que la temperatura de máxima actividad de la 𝛽-fructosidasa fue de 90 ℃ haciendo énfasis en la termoactividad y termoestabilidad de la invertasa de T. maritima. Por ello, la exploración experimental podrá abarcar un rango comprendido ente 30 ℃ y 100 ℃. La concentración de sacarosa, es otro factor de vital importancia. Desde el punto de vista industrial, el procesamiento de soluciones más concentradas disminuye el tiempo de producción según la demanda de estos productos sin embargo, puede ocurrir efectos inhibitorios y en muchas ocasiones es necesario establecer un compromiso sobre el establecimiento de las condiciones operacionales. El procedimiento metodológico propuesto inicia con la definición del problema de optimización, los objetivos experimentales y los factores y variables respuestas adecuados para la tarea de optimización prevista. Para eliminar los factores no relevantes, se deberá conducir un experimento de tamizado, donde los diseños factoriales fraccionados tienen una gran aplicabilidad; o reducción de la dimensionalidad mediante análisis de varianza. Para los factores seleccionados se establecerá el rango de estudio de acuerdo a las demandas operacionales y perspectivas futuras, con los cuales se experimentará con un modelo de primer orden como aproximación inicial al no poseer información acerca de la forma que representa la superficie respuesta y en aras de obtener la dirección óptima del movimiento en la superficie. Para el ajuste de los datos a este modelo se emplean diseños, cuya característica fundamental es su ortogonalidad y entre ellos, los más utilizados son: los diseños factoriales 2k, los factoriales fraccionados 2k-p, el diseño de Plackett-Burman y el diseño simplex. Para el mismo se efectuará prueba de significación de los coeficientes y ajuste del modelo. Si el modelo se ajusta indicará que el camino hacia la optimización es correcto y se procederá a validar el efecto de curvatura dentro de la región experimental, en caso contrario, será necesario realizar cambios en el diseño. Si no existe curvatura se efectuará la optimización de la superficie por escalonamiento previo al planteamiento del modelo de segundo orden en la zona donde se detecte curvatura. Para el ajuste experimental al modelo de segundo orden, se emplean diseños, de los cuáles los más utilizados tienen la propiedad de ser rotables como: el diseño de Box-Behnken y el DCC. Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 29 Definición del problema y los objetivos experimentales Definición de los factores y la variable respuesta Reducción de dimensionalidad mediante análisis de Varianza Establecimiento de los rangos de los factores según las perspectivas y requerimientos operacionales Experimento con un modelo de primer orden Prueba de significación de los coeficientes y ajuste del modelo Se ajusta Validación del efecto de curvatura Se detecta curvatura Optimización de la superficie: Escalonamiento ascendente (descendente) Experimento con un modelo de segundo orden Prueba de significación de los coeficientes y ajuste del modelo Se ajusta No Si Optimización de los factores Validación de los resultados mediante análisis experimental Fin No Si No Si Evaluación de la actividad residual para el reúso del biocatalizador Es estable Si No Establecer restricciones Fijar los valores de los factores experimentales Inicio Figura 2.1. Propuesta metodológica para la optimización experimental usando la MSR Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 30 Para el modelo de segundo orden se efectuará prueba de significación de los coeficientes y ajuste del modelo. Si el modelo se ajusta se optimizarán los factores, en caso contrario será necesario realizar un nuevo ajuste mediante un diseño adecuado. Dentro de los métodos de optimización de superficie de respuesta de modelos de segundo orden se encuentran: el análisis canónico y el análisis de cordillera. Para la exploración profunda de una superficie con curvatura cuando se cree que el óptimo se encuentra cerca, se emplea el análisis canónico, mientras que el análisis de cordillera está dirigido a encontrar el mejor punto posible dentro de la región experimental, ubicado sobre la cordillera óptima a partir del centro del diseño. Luego de la optimización de los factores se validarán los resultados mediante experimentación. Debido a que el principal objetivo económico y productivo de los biocatalizadores inmovilizados es su posibilidad de reúso, se han de favorecer las condiciones de mayor estabilidad, por lo que con los resultados obtenidos se ha de determinar la actividad enzimática residual para un tiempo de vida medio estimado para el biocatalizador. Si no se reportan pérdidas apreciables de actividad, se fijarán los valores obtenidos; en caso contrario se han de tomar medidas sobre las variables operacionales y establecer restricciones para la optimización. 2.3. Optimización de la hidrólisis de la sacarosa a partir de los resultados experimentales previos Para el establecimiento de las condiciones de operación, se realizó el análisis de los resultados obtenidos por (Martínez, 2015) en el estudio del comportamiento cinético del biocatalizador en un reactor discontinuo tipo tanque agitado; donde se determinó el porcentaje de hidrólisis de la sacarosa mediante la determinación de la fructosa liberada a concentraciones de sacarosa entre 0,58 M y 2,04 M, a pH 5,5, una temperatura de 60 ℃ y agitación de 100 rpm que evitó la sedimentación del biocatalizador en el fondo del reactor. La reacción se realizó en una relación de peso de biocatalizador (g): volumen de reacción (ml) de 1: 10. La MSR fue empleada para determinar la influencia de las variables independientes: concentración de sacarosa (1,46 M - 2,04 M) y tiempo (6-10 horas) en la inversión de la solución azucarada, manteniendo constante los parámetros de operación establecidos con anterioridad. Se empleó un DCC desarrollado en el software Statgraphics Centurion XV.II, que se generó a partir de los rangos establecidos, con 5 puntos centrales en el cubo (𝑛𝑜) que Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 31 fueron generados y 4 puntos axiales (𝑘) para un total de puntos en el diseño de 𝑁 = 3𝑘 + 2𝑘 + 𝑛𝑜 (Ruíz y col., 2017), donde se obtiene 102 puntos, en un total de trece corridas como se muestra en la Tabla 2.1. Tabla 2.1. DCC para las variables independientes y variable respuesta de la hidrólisis enzimática Factores experimentales Factores codificados Variable respuesta (𝑌) Corridas Tiempo (h) 𝑋1 Concentración de sacarosa (M) 𝑋2 𝑋1 𝑋2 Observado Ȳ Estimado Ŷ 1 9 1,75 0 0 73,00 72,29 2 12 1,75 1,41 0 88,00 85,60 3 9 2,16 0 1,41 40,00 39,70 4 5 1,75 -1,41 0 49,00 51,83 5 10 2,04 1 1 50,00 53,48 6 9 1,75 0 0 73,10 72,29 7 9 1,75 0 0 72,90 72,29 8 9 1,75 0 0 72,80 72,29 9 9 1,75 0 0 73,20 72,29 10 10 1,46 1 -1 90,00 94,57 11 6 1,46 -1 -1 70,00 68,52 12 6 2,04 -1 1 42,00 40,17 13 9 1,16 0 -1,41 99,80 98,86 De acuerdo a los valores promedio de los rendimientos observados (Ȳ) y estimados (Ŷ), se observa que el porcentaje de hidrólisis oscila entre 40 y 99,80 %, obteniéndose el mayor valor para una concentración de 1,16 M en un tiempo de 9 h. El modelo matemático de segundo orden (cuadrático) obtenido para este diseño fue: 𝑌 = −54,6 + 16,11𝑋1 + 103,2𝑋2 − 0,097𝑋1 2 − 34,04𝑋2 2 − 5,50𝑋1𝑋2 (2.1) Este modelo fue evaluado estadísticamente para ver el grado de ajuste a los datos experimentales. El análisis de varianza indicó que el modelo ajustado es significativo para un p valor de 0,021 (𝑝 < 0,05), donde 𝑋1 2 no resultó ser significativo como se muestra en la Figura 2.2a. La suma de cuadrados del error puro (0,10) resultó pequeña con respecto a la suma de cuadrados del total (4174,41), lo que indica una buena reproducibilidad en el punto central. Respecto al coeficiente de determinación (𝑅2), el modelo ajustado explica el 98,65 % de la variabilidad de la respuesta, por lo que se logra un buen ajuste para la optimización. Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 32 Además, existió una buena correlación entre los valores experimentales para un 𝑅2 = 0,9865 y los valores estimados para un 𝑅2 𝑎𝑗𝑢𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜 = 0,9769. (a) (b) Figura 2.2. Comportamiento de los factores experimentales: (a) Diagrama de Pareto, (b) Gráfica de contorno estimada para el % de Hidrólisis La relación entre ambos factores, se muestra en la Figura 2.2b, donde se representan contornos de la respuesta mediante curvas de nivel. La zona de maximización de la respuesta corresponde a tiempos superiores de 9 h y una concentración de sacarosa que abarca hasta 1,5 M aproximadamente. Esta región comprende los valores hacia los cuales está encaminada la optimización. La superficie de respuesta obtenida, indica un comportamiento lineal del tiempo con pendiente positiva, obteniéndose los mayores valores de inversión a los mayores tiempos de hidrólisis, mientras que la concentración de sacarosa presenta un efecto de curvatura, como se muestra en la Figura 2.3. De acuerdo a las operaciones posteriores del proceso, donde es necesario lograr una solución sobresaturada para la cristalización, es conveniente trabajar con soluciones de mayor concentración, donde se alcancen porcentajes considerables de inversión en igual período de tiempo. Para ello se optimizó con 1,75 M como restricción, alcanzándose un 85,60 % de inversión en un tiempo de 12 h. Este valor de concentración se fijó teniendo en cuenta, además del criterio anterior, que a concentraciones elevadas de sacarosa se evitan pasos de concentración, se reducen los volúmenes de operación y disminuye la posibilidad de contaminación microbiana, por la ocurrencia de plasmólisis celular; aunque se tuvo en cuenta como compromiso que a mayores concentraciones ocurren la inhibición por sustrato y los problemas de transferencia de masa. Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 33 Figura 2.3. Superficie de respuesta para los efectos tiempo-concentración de sacarosa en el porciento de hidrólisis Estudios experimentales llevados a cabo por (Martínez, 2015), para las mismas condiciones de operación, una concentración de sacarosa en la solución de 1,75 M y trascurrido un tiempo de 12 h, mostraron una conversión alcanzada de 90 %. Además, a partir de la ecuación cinética de primer orden de un reactor discontinuo en condiciones isotérmicas: 𝑋𝐴 = 1 − 𝑒−𝑘𝑡 con una constante cinética de 0,148 h-1 determinada a partir de la expresión estimada por el autor para concentraciones inhibitorias de sacarosa dentro del rango de estudio, donde se relaciona la concentración inicial de sacarosa (Sa0) y el peso del biocatalizador (W): 𝑘 = (−0,0432𝑔−1ℎ−1𝑀−1𝑆𝐴0 + 0,1054)𝑊, se pudo determinar una conversión fraccional esperada de 83 % para iguales condiciones de reacción. Por lo tanto, se puede afirmar que existe correspondencia entre los resultados teóricos esperados, lo experimentales y los obtenidos con la optimización de la superficie respuesta desarrollada. En estudios realizados sobre la estabilidad de reúso del biocatalizador para estas condiciones, se obtuvieron valores donde la pérdida de la actividad residual no fue considerable para un total de 16 inversiones. 2.4. Propuesta de escalado de la reacción biocatalizada por PpABfrA La concepción tecnológica de estos procesos, expuesta en el epígrafe 2.3, demuestra los resultados obtenidos mediante la hidrólisis de las soluciones de sacarosa en un reactor discontinuo. (Martínez, 2015) lleva a cabo ensayos de esta reacción en un birreactor de 0,5 L, con una velocidad óptima de agitación de 100 rpm, con un impelente de hélices. Las condiciones cinemáticas para esta reacción fueron: 60 ℃, pH 5,5; concentración de sacarosa inicial 1,75 Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 34 M; relación peso del biocatalizador: volumen de sustrato (kg/l) 1:10. La reacción de biocatálisis se llevó a cabo bajo este régimen por 12 h de operación, condiciones que coinciden con la optimización de los resultados experimentales. El escalado de este sistema a un reactor prototipo de 5 L, arrojó resultados satisfactorios cuando se mantiene constante la velocidad en la punta del impulsor, obteniendo una conversión fraccional experimental de 0,9 transcurrido el tiempo total de reacción, similar a la conversión teórica esperada de 0,83 al aplicar la ecuación cinética para concentraciones inhibitorias de sacarosa, y los resultados obtenidos al aplicar la metodología de superficie respuesta para un valor de 0,856. Tabla 2.2. Características de diseño de los birreactores modelo y prototipo Características Modelo (5 L) Prototipo (500 L) Diámetro del impelente (𝐷𝑖) 0,05 m 0,23 m Diámetro del biorreactor (𝐷) 0,15 m 0,94 m Altura del impelente (ℎ) 0,045 m 0,209 m Volumen total 7 L 650 L Volumen de trabajo 5 L 500 L Tipo de impelente hélice hélice Los valores reportados en la Tabla 2.2, representan las características de diseño del reactor piloto propuesto a partir de este reactor como modelo. La operación del biorreactor modelo se realizó homogenizando el sistema a una velocidad de agitación de 60 rpm, en correspondencia con los resultados obtenidos al aplicar el criterio de escalado seleccionado. Por tanto, el procedimiento de escalado se realizó teniendo en cuenta las condiciones establecidas y sus características geométricas. 2.4.1. Análisis de las consecuencias de la aplicación de los diferentes criterios de escalado para la operación del biorreactor piloto (500 L) Considerando los criterios de escalado de reactores agitados presentados por (Rodríguez y Blázquez, 2010), y teniendo en cuenta que en ambas escalas la similitud química se garantiza a través de la relación peso del biocatalizador: volumen de sustrato (kg/l) e igual temperatura y pH; la similitud geométrica se estableció mediante las relaciones propuestas en la Tabla 2.3. Además se tuvo en cuenta la recomendación de la relación diámetro de impelente (𝐷𝑖)/ diámetro del tanque (𝐷) entre 0,2 y 0,5 y una relación altura del impelente (ℎ)/ diámetro del impelente entre 0,5 y 1, para agitadores de hélice. Teniendo en cuenta estos criterios se mantuvo una relación constante 𝐷𝑖/𝐷=0,3 (Tabla 2.3) y ℎ/𝐷𝑖= 0,9, dentro de los rangos de diseños establecidos por (Kasatkin, 1985). Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 35 Tabla 2.3. Similitud geométrica de los reactores modelo y prototipo Reactor Modelo (m) Reactor prototipo (p) 𝑉𝑚 𝑉𝑝 = 𝜋𝐷𝑚 3 4 𝜋𝐷𝑝 3 4 = 5 𝐿 500 𝐿 (3𝐷𝑖𝑚)3 (3𝐷𝑖𝑝)3 = 0,01 𝐷𝑖𝑝 = 4,64 𝐷𝑖𝑚 𝐻𝑚 = 𝐷𝑚 𝐻𝑝 = 𝐷𝑝 𝐷𝑖𝑚 = 1 3 𝐷𝑚 𝐷𝑖𝑝 = 1 3 𝐷𝑝 𝑉𝑚 = 𝜋𝐷𝑚 2𝐻𝑚 4 𝑉𝑝 = 𝜋𝐷𝑝 2𝐻𝑝 4 𝑉𝑚 = 𝜋𝐷𝑚 3 4 = 5 𝐿 𝑉𝑝 = 𝜋𝐷𝑝 3 4 = 500 𝐿 Garantizada las similitudes geométricas de los reactores de diferentes escalas, se analizaron los siguientes criterios de escalado y sus consecuencias de aplicación sobre los diferentes parámetros: Igual velocidad en la punta del impulsor (𝑁𝐷𝑖)𝑚 = (𝑁𝐷𝑖)𝑝 𝑁𝑝 = 𝑁𝑚𝐷𝑖𝑚 𝐷𝑖𝑝 (2.1) 𝑅𝑒𝑝 = 𝑁𝑝𝐷𝑖𝑝 2𝜌 𝜇 (2.2) 𝑃𝑝 = 𝐾𝑁𝑝𝑁𝑝 3𝐷𝑖𝑝 5𝜌 (2.3) Igual potencia volumétrica (𝑃/𝑉)𝑚 = (𝑃/𝑉)𝑝 ∝ 𝑁3𝐷2 𝑃𝑝 = ( 𝑃 𝑉 ) 𝑚 𝑉𝑝 (2.4) 𝑁𝑝 3𝐷𝑖𝑝 2 = 𝑁𝑚 3𝐷𝑖𝑚 2 (2.5) El 𝑅𝑒𝑝 se determinó por la ecuación 2.2 Igual velocidad del impulsor 𝑁𝑚 = 𝑁𝑝 𝑅𝑒𝑝 = 𝑁𝑚𝐷𝑖𝑝 2𝜌 𝜇 (2.6) La 𝑃𝑝 se determinó por la ecuación (2.3) Igual potencia 𝑃𝑝 ∝ 𝑁3𝐷5 𝑁𝑝 3𝐷𝑖𝑝 5 = 𝑁𝑚 3𝐷𝑖𝑚 5 (2.7) El 𝑅𝑒𝑝 se determinó por la ecuación 2.2 Igual Reynolds 𝑅𝑒𝑝 = 𝑅𝑒𝑚 𝑁𝑝 = 𝑅𝑒𝑚𝜇 𝐷𝑖𝑝 2𝜌 (2.8) La 𝑃𝑝 se determinó por la ecuación (2.3) Donde 𝑁 es la velocidad de agitación en (rps); 𝑃 es la potencia (W); 𝐷𝑖 es el diámetro del impelente (m); 𝑅𝑒 es el número de Reynolds de mezclado (unidades adimensionales); 𝐾𝑁 es Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 36 el número de potencia (Rosabal y Garcell, 2006); 𝜌 es la densidad en (kg/m3); 𝜇 es la viscosidad en (Pa.s); los subíndices m y p se refieren al modelo y prototipo respectivamente. La selección de uno u otro criterio de escalado está sujeto al análisis de las consecuencias de adoptar cada uno de ellos en nuestro sistema de reacción. La determinación de las consecuencias se realiza a través del cálculo teórico de cada uno de los parámetros que caracteriza el sistema. En el Anexo 3 se muestran los cálculos para la determinación de los diferentes parámetros para el prototipo según el criterio de escalado. En la tabla 2.4 se muestra el resumen del comportamiento de los diferentes parámetros para el prototipo según el criterio de escalado aplicado. Tabla 2.4. Valores de los parámetros según el criterio de escalado aplicado Criterios de escalado Modelo Valores en el prototipo Np (rpm) NpDip (rpm·m) Rep Pp (W) (P/V)p (W/L) Ncte 60 1,0 Nm 60 4,64NDim 13,9 21,53Rem 1,2 · 104 103Pm 2,4 · 10−1 10(P/V)m 4,8 · 10−4 NDcte 3 0,22 Nm 13 1,0NDim 3,0 4,64Rem 2,6 · 103 13,8Pm 3,3 · 10−3 0,14(P/V)m 6,6 · 10−6 Recte 553 2,8 · 10−2Nm 1,66 0,13NDim 0,38 1,0Rem 553 4,6 · 10−2Pm 1,1 · 10−5 4,6 · 10−4(P/V)m 2,2 · 10−8 Pcte 2,4 · 10−4 7,7 · 10−2Nm 4,65 0,36NDim 1,08 1,66Rem 917 1,0Pm 2,4 · 10−4 0,01(P/V)m 4,8 · 10−7 P/Vcte 4,8 · 10−5 0,36Nm 22 1,67NDim 5,0 7,75Rem 4,3 · 103 100Pm 2,4 · 10−2 1,0(P/V)m 4,8 · 10−5 Al analizar los resultados mostrados se observa que, si se mantiene como criterio de escalado igual velocidad en la punta del impulsor, el número de Reynolds de mezclado se incrementa 4,6 veces, proporcionalmente al aumento del diámetro del agitador. Al mismo tiempo, disminuye la velocidad de agitación, asegurando un régimen de mezclado, que al igual que el ensayado inicialmente, sea capaz de garantizar la homogeneidad y difusión de la sacarosa como parte de los mecanismos de transferencia de masa, propiciando la llegada del sustrato a los centros activos del catalizador biológico, donde ocurre la mayor parte de la reacción y pueda a su vez, lograr mantener las perlas en suspensión. Además, se comprobó un incremento de la potencia total de 13,8 veces y una disminución de la potencia volumétrica de 0,14 veces respecto al biorreactor modelo. Teniendo en cuenta estos resultados, con la Capítulo 2. Propuesta metodológica para la conducción experimental y optimización de la hidrólisis enzimática de la sacarosa 37 aplicación de este criterio se han de lograr resultados satisfactorios en la operación del reactor prototipo. La aplicación de otros criterios de escalado fue descartada. Por ejemplo, si se mantiene constante la velocidad de agitación se producirá un aumento en el consumo de potencia de 1000 veces, mientras que para igual potencia volumétrica se produce un incremento de 100 veces, lo que económicamente no es factible. Al aplicar los criterios de igual potencia o igual número de Reynolds de mezclado, no se logrará la homogeneidad requerida en el sistema para garantizar la suspensión de las perlas y la difusión de la solución de sacarosa; causado fundamentalmente por la notable diminución de la potencia por unidad de volumen y la velocidad de agitación en la punta del impelente. 2.4.2. Requerimientos de transferencia de calor para el biorreactor piloto Para la ejecución de los balances de calor intercambiado en la chaqueta, se determinó el calor de reacción a una temperatura de 60 ℃, mediante la ecuación de Kirchoff (Matos y Hing, 2014) como se muestra en la Tabla 2.5, teniendo en cuenta que la temperatura de entrada del sustrato sea i