UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO ACADÉMICO DE MASTER EN CIENCIAS PATÓGENOS ASOCIADOS AL SÍNDROME DIARREICO PERINATAL Y POSTDESTETE EN CERDOS DE VILLA CLARA AUTOR: Dr.M.V. JAVIER AGUIAR SOTELO TUTOR: Dr.M.V. PEDRO YOELVIS DE LA FE RODRIGUEZ MsC. CONSULTANTE: Ing. REINALDO QUIÑONES RAMOS MsC. 2009 RESUMEN En el presente trabajo se evaluaron algunos de los principales agentes etiológicos presentes, en 90 cerditos sacrificados con síntomas diarreicos. Dividiéndose en un grupo de cerdos lactantes en las edades comprendidas entre 0 y 25 días de edad y un grupo de cerdos de preceba en las edades comprendidas entre 26 y 50 días de edad, procedentes de 6 cochiqueras de la provincia de Villa Clara. A la totalidad de los cerditos sacrificados les fueron medidos los parámetros hemáticos convencionales, glicemia por la técnica de glucosa oxidasa, temperatura rectal, estudio anatomopatológico macroscópico, examen parasitológico, (Isospora por métodos clásicos y Cryptosporidium parvum por DAS-ELISA, diagnóstico de rotavirus por ELISA sándwich con doble anticuerpos, coronavirus (Gastroenteritis transmisible y Diarrea Epidémica), por inmunocromatogragia, Clostridium perfringens por el método DAS ELISA con doble anticuerpos, y detectabilidad de las toxinas alfa, beta y épsilon, y Salmonella spp por métodos convencionales. La prevalencia de E. coli (fimbriales F-4 y F-18) se llevaron a cabo por un método Immuno-dot-blot bacteriológico usando anticuerpos monoclonales contra estas fimbrias. Se analizaron los resultados obtenidos, los que evidenciaron elevada prevalencia de cerditos con problemas anémicos e hipoglicémicos. A excepción de la Salmonella spp todos los demás patógenos entéricos manifestaron elevados porcentajes de prevalencia; rotavirus (6,67%), coronavirus (10%), C. parvum (10%), I. suis (6,67%), toxina alfa (8,89%), toxina beta (7,78%), toxina epsilon (10%), Salmonella enterica serovar Newport (2,22%), E. coli f4 (16,66%) y E. coli f18 (8,89%). El análisis estadístico evidenció diferencias significativas entre los patógenos entéricos entre categorías y entre cochiqueras; y correlaciones existentes entre virus, bacterias y parásitos. PENSAMIENTO “Sólo los necios hablan de desdichas, o los egoístas. La felicidad existe sobre la tierra; y se la conquista con el ejercicio prudente de la razón, el conocimiento de la armonía del universo, y la práctica constante de la generosidad”. José Martí. AGRADECIMIENTOS Debo manifestar mi más sincero agradecimiento:  A mi familia, en especial a mi madre, que me han apoyado en todo momento.  A mi tutor Pedro de La Fe, que sin su ayuda no habría podido culminar esta tesis.  A mi consultante Reinaldo Quiñones, quien con esmero y dedicación me brindó su ayuda.  A los profesores del Departamento de Medicina Veterinaria y Zootecnia.  A mis amigos en general.  A todos aquellos que de una forma u otra me han brindado apoyo y han contribuido en mi formación. A todos ellos: Muchas Gracias DEDICATORIA Dedico la presente tesis:  A mi familia y amigos, aquellos que siempre han estado presentes en cada una de las etapas de mi vida.  A todos los que han contribuido en mi formación profesional tanto de pregrado como de postgrado. ÍNDICE INTRODUCCIÓN________________________________________________ 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA_______________________________________ 4 Coccidiosis. Epidemiología___________________________________ 4 Escherichia coli enterotoxigénica. Epidemiología________________ 10 Clostridium perfringens. Epidemiología.________________________ 21 Rotavirus. Epidemiología.____________________________________ 34 MATERIALES Y MÉTODOS_______________________________________ 42 Diseño Experimental_________________________________________ 42 Características de los animales________________________________ 43 Características de las muestras________________________________ 43 Investigaciones realizadas_____________________________________43 Análisis estadístico__________________________________________ 47 RESULTADOS Y DISCUSIÓN______________________________________48 CONCLUSIONES________________________________________________67 RECOMENDACIONES____________________________________________68 BIBLIOGRAFÍA_________________________________________________ 69 1 INTRODUCCIÓN La diarrea en cerdos es un problema complejo que resulta de la interacción entre los agentes infecciosos, la inmunidad del hospedero y los procedimientos de manejo. Esta causa considerables pérdidas económicas en la industria de la producción porcina, especialmente en cerdos lactantes y destetados. (Moxley & Duhamel, 1999; Saif, 1999). Las medidas preventivas y el diagnóstico son difíciles por la amplia variedad de patógenos entéricos que pueden ser aislados en los cerditos de esta edad. La causa más común de diarrea en los cerditos son los coronavirus (incluyendo el virus de la gastroenteritis transmisible y el virus de la diarrea epidémica porcina), rotavirus, Escherichia coli enterotoxigénica, Clostridium perfringes y coccidia (incluyendo Isospora suis y Cryptosporidium parvum). Estos patógenos entéricos cuentan para la mayor proporción de los casos de diarreas en cerditos (Morin et al., 1983; Holland, 1990; Johnson et al., 1992). Investigaciones puntuales en la determinación de la prevalencia de estos patógenos han sido conducidas a nivel mundial. Sin embargo muchos estudios de han concentrado solamente a un patógeno simple y esto es una información inadecuada concerniente a otros patógenos entéricos relevantes. A través de algunas investigaciones fueron concentradas sobre infecciones mixtas, esto fue reportado por más de 10 años y son únicamente para reflejar la situación epidemiológica existente (Morin et al., 1983; Johnson et al., 1992; Driesen et al., 1993). La identificación de la prevalencia de los agentes es probablemente para mejorar nuestro entendimiento de la epidemiología de esta enfermedad, así como proveer información acerca de las terapias o vacunaciones más apropiadas (Katsuda et al., 2006) Las enfermedades del tracto gastrointestinal que afectan a los cerdos en todas sus etapas, son los mayores factores que limitan la eficiencia y el desarrollo de la producción global porcina. (Thompson et al., 2004) El interés creciente en la entero patología porcina, ha permitido desarrollar de forma marcada, líneas de investigación en la Fisiología e Inmunológica porcina a nivel mundial en busca de prácticas mas eficientes para la prevención y control 2 de estas enfermedades. La conformación y la eficiencia en el crecimiento de los cerdos, ha cambiado dramáticamente en los últimos años, como resultado de la selección genética y la creación de híbridos, no existiendo cambios en la morfología gastrointestinal, excepto en el desarrollo de genotipos resistentes a las infecciones por E. coli F-18 y F-4 (K-88) los cuales no poseen receptores intestinales para estos microorganismos. (Straw, et al., 2006) La maduración intestinal en los cerdos ocurre rápidamente después del nacimiento, en respuesta a factores tales como, la oxigenación, presencia de nutrientes, y estado hormonal entre otros, por lo que la hipoxia neonatal, esta asociada con la disfunción intestinal y el incremento de enterocolitis, siendo el aumento de oxigenación de la sangre arterial intestinal, un elemento vital para su desarrollo. (Poseí et al., 1999). Dentro de las patologías entéricas mas frecuentes y asociadas, en los cerdos en los períodos neonatales y post destete se encuentran: las infecciones por E. coli, Rotavirus, Coronavirus, (Gastroenteritis transmisible (GET) Diarrea epidémica Porcina (DEP) Adenovirus, virus de la enfermedad de Aujeszky, Salmonellas, Clostridium perfringens tipos A y C, Cryptosporidium, e Isosporas, siendo complicado lograr una alta efectividad diagnóstica en condiciones de producción. No obstante mundialmente se consideran como los mas importantes causantes de diarreas la E. coli, Isospora suis y rotavirus, otros como el Clostridium perfringens y la GET no son muy frecuentes. (Spicer et al., 1986). Algunos de los principales factores de riesgo para la aparición de enteritis los son: la edad ya que el 60% de las muertes ocurren en la primera semana de vida, el 10.5% en la segunda y el 1.3% con posterioridad. Las muertes por enteritis ocurren principalmente en los primeros 5 días, debidas a E. coli enterotoxigénicas. (Fairbrother et al., 2005.) Escherichia coli es un importante patógeno entérico de cerdos neonatos y destetados, también puede perturbar la mucosa intestinal permitiendo a la bacteria ir desde la mucosa a la sangre y órganos internos causando septicemia (Holm y Poulsen, 1996). 3 Cicuta et al., (2000) caracterizan la enfermedad como endémica altamente transmisible y por presentar un desenlace generalmente fatal, originando considerables pérdidas económicas en lechones entre las 4 y 12 semanas de vida. En nuestro país, la colibacilosis es una de las primeras causas de mortalidad infecciosa en cerdos neonatos y según datos del IMV, con una pérdida anual de hasta un 10 %, lo cual afecta la economía nacional en más de un millón de pesos (MN). Muchas de estas pérdidas son provocadas por la debilidad y el incremento de su predisposición a otras enfermedades del animal que sobrevive, además del costo en fármacos y el personal relacionado con el manejo del animal (Wong et al., 1996). De forma global en nuestro pais la prevalencia de procesos gastroentericos en el año 2008 ascendió al 31%. (IMV. 2008) De acuerdo a todo lo anteriormente expresado y considerando que el Síndrome Diarreico Porcino tiene un origen polietiológico, nos proponemos los siguientes objetivos: Objetivo general: - Identificar los agentes asociados al síndrome diarreico en cerditos lactantes y postdestetados. Objetivos específicos: - Determinar la prevalencia de cada uno de los agentes causales del síndrome diarreico por categorías y por cochiqueras. - Evaluar las correlaciones existentes entre los patógenos entéricos estudiados. - Identificar otras causas asociadas al síndrome diarreico porcino. 4 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Coccidiosis. Epidemiología. La coccidiosis es una enfermedad de los cerditos jóvenes debido a la infección con Isospora suis y está caracterizada por una diarrea que no es sensible a la terapia anti-bacteriana. Hay morbilidad y mortalidad variables. Los cerditos desarrollan un cuadro clínico más severo de la enfermedad y enteritis cuando está infectado con I. suis de uno a tres días de edad que cuando se infecta a las dos semanas de edad. Al microscopio de pueden observar lesiones que van desde una erosión suave y atrofia de las vellosidades hasta una enteritis fibronecrótica severa. Esta enfermedad en cerditos domesticados es generalmente un resultando del confinamiento de una gran cantidad de animales. Al colocarse cerdos salvajes en confinamiento podría también producir un ambiente conveniente para el desarrollo de la coccidiosis neonatal. La coccidiosis se debe considerar en el diagnostico diferencial de la diarrea neonatal dentro de estos animales. La Coccidiosis en cerdos se asocia normalmente a cerditos lactantes entre 5 y 15 días. Provocando diarreas que pueden causar hasta un 20 % de mortalidad y afectando el crecimiento de los demás. El diagnóstico de Isospora suis es invariable en estos casos (Cook , 1996; Taylor, 1999). Taylor, (1999) en sus investigaciones demostró que esta enfermedad es raramente reportada, sin embargo del 3 al 15 % de las unidades investigadas se encontraban afectadas. Mondal et al., (1998) identificaron ocho especies importantes de coccidias en cerdos de 1 a 60 días de edad. Henry and Tokach, (1995) reportaron una situación similar. La Isosporosis neonatal causada por la Isospora suis es una de las enfermedades que causa diarrea amarillento-pastosa en cerditos. La enfermedad se considera una enteroparasitosis importante en cerdos jovenes entre 5 y 20 días de edad que causa pérdida económica severa en la industria de los cerdos. La I. suis no responde a los antibióticos y causa alta morbilidad y baja mortalidad. El tratamiento Anticoccidial de los cerdos ha probado 5 generalmente ser ineficaz aunque el toltrazuril haya demostrado ser eficaz contra I. suis bajo condiciones experimentales y de campo. La prevención con el buen saneamiento es una de las maneras más conocidas de controlar la enfermedad (Mundt, 1994). La coccidiosis en en cerditos es una enfermedad causada por el coccidium Isospora suis. Ha sido encontrada en todos los tipos de crianza y sistema de manejo. Los cerditos con coccidiosis clínica manifiestan una diarrea no hemorrágica característica que no responde a la terapia antibiótica rutinaria. Las diarreas tienden a aparecer entre 6 y 10 días, variando de heces pastosas blancas a diarrea acuosa amarillenta. Cerditos severamente afectados pueden llegar a estados de deshidratación. La ganancia de peso se ve afectada en los cerditos enfermos. La mortalidad es usualmente baja o moderada. I. suis es el patógeno primario que puede causar enteritis por si solo o como una infección concurrente con Escherichia coli, rotavirus y virus de la gastroenteritis transmisible (Driesen et al., 1993; Niestrath et al., 2002; Gualdi et al., 2003; Mundt et al., 2006). Las lesiones causadas por I. suis se presentan en el yeyuno e íleon y están asociadas con los estadíos de desarrollo del parásito. Pueden variar de leves a severas en dependencia del número de oocyst esporulados ingeridos. Los cambios microscópicos consisten en atrofia y fusión de las vellosidades, enteritis necrótica e hiperplasia en las criptas. Solo algunos estudios han sido reportados sobre el desarrollo de la respuesta inmune y la edad de resistencia natural a infecciones de I. suis en cerdos. Hasta el presente no está confirmado si la inmunidad puede estar debida a mecanismos inmunes específicos o resistencia natural con la edad-maduración de componentes no específicos del sistema inmune. La vacunación prospectiva contra I. suis tiene como inconveniente un efecto inhibidor de los anticuerpos derivados maternos y un sistema inmune inmaduro. Para el control de la enfermedad la llave se encuentra en mejorar el saneamiento y la quimioterapia con compuestos anticoccidiales (Koudel & Kucerová, 2000). 6 La Isosporosis en los cerditos, causada por el Coccidium Isospora suis, se reconoce como una enfermedad con un impacto negativo significativo en la industria del cerdo, no como causa de alta mortalidad, pero sí reduciendo la productividad y erosionando las vueltas económicas a los productores de cerdo (Torres, 2004). Gaudie et al., (2005) identificaron 6 especies de Eimeria en cerditos con enfermedad clínica aparente. Donde la principal causa detectada fue la contaminación de las camas de paja con oocistos. Demostrando que las especies de Coccidia al igual que las especies de Eimeria pueden causar la enfermedad y la importancia de un examen histológico a los animales jóvenes y establecer un diagnóstico exacto en los casos de enfermedades entéricas. La Isospora suis es un parásito común en la cría intensiva del cerdo y se mira como causa primaria de la diarrea en cerdos en la etapa de cría (Driesen et al., 1993; Meyer et al., 1999). Sin embargo, el parásito se pasa por alto a menudo porque al inicio la excreción del oocyst se retrasa en lo referente a muestras clínicas, y por lo tanto el examen coprológico de las muestras diarreicas rinden a menudo resultados negativos (Niestrath et al., 2002). Cuando los oocysts son presente pueden ser detectados en borrones de transferencia directos o por técnica de la flotación; sin embargo, ambos son inadecuados para la detección de números bajos de oocysts en heces de de los cerditos debido a la sensibilidad pobre (Daugschies et al., 2001). Sin embargo, la detección por autofluorescencia realza perceptiblemente la sensibilidad en los borrones de transferencia directos (Daugschies et al., 2001). La reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) se está utilizando cada vez más para el diagnóstico de varios protozoos con importancia para el ser humano y en veterinaria. Permite la detección altamente específica y sensible de DNA del parásito. En un estudio anterior los primers de I. suis fueron construidos y utilizados para la amplificación del DNA propio de cada especie de los oocysts purificados de muestras fecales (Ruttkowski et al., 2001). Basándose en este trabajo Joachim et al., (2004) desarrollaron y evaluaron una prueba de PCR para 7 la detección de I. suis muestras fecales y las compararon con técnicas coproscópicas. Roepstorff et al., (1998) Demostraron que la Coccidia (en gran parte I. suis) fueron muy comunes en cerditos en Dinamarca, Islandia y Suecia con marcados rangos de prevalencia similares, mientras tanto bajos rangos fueron encontrados en Finlandia y solo dos cerditos fueron positivos para I. suis en Noruega. Los porcientos de prevalencia de la coccidia en cerdos en crecimiento fueron más altas en Islandia comparado con Dinamarca, Finlandia, Noruega y Suecia, mientras tanto todos los países tuvieron baja prevalencia coccidial (solamente Eimeria spp. identificada) en los cerdos adultos. Las infecciones con coccidia intestinal de la familia Eimieridae están entre las infecciones más importantes económicamente en mamíferos criados intensivamente y los costos en la profilaxis y el tratamiento son considerables. Para la evaluación de métodos de control, los modelos de infección experimental son las herramientas para el estudio de la coccidiosis en los diferentes animales (Mundt et al., 2006). Diversas especies de Eimeridae existen en cerdos, pero solamente la Isospora suis es reconocida como patógeno de importancia económica (Mundt et al., 2003, 2005a,b). Varios estudios de campo ha demostrado la amplia distribución e importancia de la isosporosis en cerditos lactantes (Mundt et al., 2005a,b), pero solo algunos estudios con modelos experimentales de la enfermedad han mostrado patrones de excreción (del Castillo et al., 1996; Martineau and del Castillo, 2000) y susceptibilidad relacionada a la edad (Koudela and Kučerová 1999, 2000; Wieler et al., 2001; Damryiasa and Bauer, 2004). Esto ha llevado a una cosiderable estimación de la prevalencia e importancia de esta infección en el pasado (Martineau and del Castillo, 2000). Mundt et al., (2006) desarrollaron y establecieron un modelo para el studio de las infecciones por I. suis en cerditos bajo condiciones estandarizadas y evaluaron este modelo con respecto a los parámetros clínicos, patológicos y parasitológicos, sus variaciones y sus variables optimizadas. 8 La diarrea en cerditos lactantes se observan con frecuencia en las granjas porcinas. Una de las principales razones de la misma es la infección con Isospora suis. Este parásito coccidial es detectado en todo el mundo y ocurre con más frecuencia en las grandes granjas porcinas. (Driesen et al., 1993; Karamon et al., 2007a; Meyer et al., 1999; Mundt et al., 2005). La Isosporosis clínica concierne solamente a los cerditos lactantes, particularmente entre la 2da y 3ra semana de vida. El síntoma principal es la diarrea, donde las heces son líquidas o pastosas amarillentas o pardas. Para la confirmación del diagnóstico es necesario un examen para la detección de oocystos de I. suis. Los básicos y más populares son los exámenes coproscópicos, entre ellos los métodos de flotación, los cuales son frecuentemente usados en los diagnósticos de rutina. Sin embargo, un examen efectivo y la obtención de resultados reales se hace difícil por diversas razones. Uno de estos es el alto contenido de grasa en las heces diarreicas de cerdos lactantes. Durante el proceso de flotación, las fracciones de grasas en una solución saturada hacen difícil el examen microscópico y la detección de oocystos. Entonces esto constituye un alto riesgo de obtener resultados falsos negativos. Los problemas realcionados con el alto contenido de grasa en heces diarreicas fueron solucionados por diferentes vías. Porque estas dificultades en el diagnóstico fueron expuestas generalmente en los métodos de flotación, el examen citológico directo de las heces fue propuesto como una alternativa, pero fue solamente efectivo durante una excreción masiva de oocystos. Por otra parte, la detectabilidad en heces grasosas fue significativamente incrementada por el uso de autofluorescencia de los oocystos con luz ultravioleta (Daugschies et al., 2001). Sin embargo, es necesario un microscopio fluorescente para que este método sea efectivo y muchos laboratorios, especialmente los pequeños laboratorios de campo, no están bien equipados. Fueron desarrollados y frecuentemente aplicados mejoramientos para los métodos de flotación haciendo más clara la transparencia de los campos microscópicos y enriqueciendo la 9 solución de flotación. Sin embargo tuvo desventajas en los casos que no se eliminó la grasa de la muestra. Karamon, et al., (2008) usaron un método modificado en el cual la muestra fue sometida a un método de flotación después de remover las fracciones de grasa. Parcialmente cada una de las sospechas fue confirmada a través del método usado por Meyer et al., (1999) donde las muestras fecales fueron filtradas a través de gaza, en las cuales fueron retenidas las partículas grandes y también las partículas de grasa. Karamon, et al., (2008) en su investigación, decidieron remover las fracciones de grasa de la muestra fecal con el uso de una preparación de Percoll. El Percoll es una suspensión coloidal de partículas de sílice coaptadas con polyvinylpyrrolidone (PVP). Esta es una sustancia que hace posible las separación de de fracciones de moléculas contenidas en la mezcla con diferentes densidades. El Percoll ha sido también usado por algunos autores para el aislamiento de oocystos de Cryprtosporidium sp. de las heces (Suresh and Rehg, 1996). La información recibida del Dr H. Ch. Mundt (Bayer AG, Leverkusen, Alemania) y una de las experiencias de Karamon, et al., (2008), conectadas con el aislamiento de de grandes número de oocystos durante infecciones experimentales con I. suis, mostraron que, gracias a la centrifugación con 25% de Percoll en solución acuosa, fue posible la separación y eliminación de la grasa de las heces. Desde la primera vez que fue descrita en cerdos la I. suis ha sido reportada en muchos países del mundo con prevalencias que oscilan del 17.3 % al 53.8 % (Driesen et al., 1993; Sayd & Kawazoe, 1996; Chae et al., 1998; Permin et al., 1999; Meyer et al., 1999; Niestrath et al., 2002; Hamadejova & Vitovec, 2005; Mundt et al., 2005; Weng et al., 2005; Damriyasa & Bauer, 2006; Karamon et al., 2007). Actualmente se concoce poco acerca de la importancia y la prevalencia de la I. suis en el occidente de Australia. Johnson et al., (2008) presentaron un estudio para determinar la prevalencia de Isospora suis en cerdos domésticos pre y postdestete en el occidente de Australia usando un ensayo de PCR-RFLP 10 recientemente desarrollado basado en la región rDNA ITS-1 del genotipo de Isosporas aisladas (Samarasinghe et al., 2007). E. coli enterotoxigénica (ETEC). Epidemiología. La Colibacilosis es causada normalmente por cepas enterotoxigénicas de E. coli, aunque algunas cepas no enterotoxigénicas de dicha bacteria pueden ocasionalmente causar enfermedad. Las enterotoxinas producidas por E. coli patogénica incluyen toxinas termolábiles, y toxinas termoestables. Estos organismos también tienen fimbrias que son factores de adherencia a la mucosa intestinal, tales como: K 88, K 99, 987P, F41 y F18. Las cepas patogénicas colonizan el intestino delgado por medio de factores específicos de colonización (fimbrias) y producen una o varias endotoxinas responsables de la enfermedad (Bertschinger, 1999). Las enfermedades diarreicas de los animales de granja y/o hombre son frecuentemente debido a la infección por uno u otro patotipo de Escherichia coli: enterotoxigénica (ETEC), productoras de toxinas Shiga o Vero (VTEC o STEC), necrotoxigénica (NTEC, por sus siglás en Inglés), enteropatogénica (EPEC, por sus siglas en Inglés), enterohemorrágica (EHEC, por sus siglas en Inglés), enteroagregativa (EAggEC, por sus siglas en Inglés), y enteroinvasiva (EIEC, por sus siglas en Inglés). De estos patotipos, ETEC es una importante causa global de diarrea acuosa severa en la descendencia de algunas especies de animales tales como terneros recién nacidos (lactantes) y cerdos lactantes y destetados. Interesantemente, es muy rara o no existe en algunas importantes especies de animales de granja como conejos, caballos y aves de corral, para lo cual no hay una explicación en el presente, como estos animales parecen tener receptores y ser receptivos a enterotoxinas y adhesinas de algunas ETEC (Bouckenooghe et al., 2002). Es conocido que ETEC se adhiere al epitelio del intestino delgado sin inducir cambios morfológicos significativos, y para secretar proteínas (enterotoxinas) que alteran la función de los enterocitos incrementando la secreción y reduciendo la absorción. De esa manera los atributos de virulencia principales 11 de ETEC son adhesinas (primeramente apéndices en formas de pelos, llamados fimbrias o pili) y enterotoxinas (proteínas o péptidos). En adición a factores de virulencia adhesivos y enterotóxicos, la patogénesis también involucra factores del hospedero, los más importantes de los cuales son los receptores para las adhesinas y para enterotoxinas. La especificidad de especie, que es una característica general de las infecciones por ETEC, es ampliamente debida a la presencia de receptores específicos en solamente uno o en un limitado espectro de especies animales. Debido a las especificidades de receptor de adhesinas, las cepas de ETEC parecen ser totalmente específicas de hospedero (Nagy & Fakete, 2005). Diversos factores de virulencia enterotóxicos y adhesivos de ETEC y sus receptores en animales ya son conocidos pero otros son parcialmente entendidos o completamente desconocidos. En la década pasada nuevos rasgos de potenciales de virulencia de algunas ETEC han sido descritas, nuevas enterotoxinas (EAST1, por sus siglas en Inglés), nueva fimbria (tipo IV; Pichel et al., 2002), y proteínas de invasión celular para ETEC (Elsinghorst & Weitz, 1994), proteína autotransportadora (Moormann et al., 2002), y citolisina (Ludwig et al., 2004). Además, hay un interesante vehículo genético transportador de genes de virulencia de ETEC originalmente derivado de otras especies de bacterias: aislados de alta patogenicidad de Yersinia patogénica en ETEC (Wang et al., 2002, 2003), o los nuevos aislados de patogenicidad asociados a plásmidos (Fakete et al., 2003), el significado patogenético y los arreglos moleculares específicos, los cuales aún no han sido determinados. Además hay mucho que aprender, acerca de los mecanismos moleculares, biogénesis y perspectivas de evolución de los nuevos atributos de virulencia y acerca de las nuevas oportunidades para aplicar nuestro conocimiento en el diagnóstico y prevención ETEC en los animales (Nagy y Fakete, 2005). La ETEC es la causa más común de diarrea en los animales de granja. Estas cepas producen una o más adhesinas fimbriales y enterotoxinas. Las adhesinas fimbriales más frecuentemente encontradas de ETEC en cerdos son F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41 y F18. Los aislados productores de adhesinas F4 o 12 F18 y ciertos aislados F6 son hemolíticos. Las enterotoxinas producidas por la ETEC pueden ser termoestables (Sta, STb o Enterotoxina 1 termoestable de E. coli enteroagregrativa (EAST 1) o termolábil (LT) (Fairbrother et al., 2005). EPIDEMIOLOGÍA. En cerdos, las infecciones más comunes y severas de E. coli enterotoxigénica (ETEC) son causadas por cepas que expresan fimbrias F4+, enterotoxina termolábil (LT), enterotoxina termoestable b (STb) (Erume et al., 2008). La diarrea postdestete y la mortalidad causada por Escherichia coli F4 es un importante problema de enfermedad en Ontario. En estudio transversal que incluyó 70 granjas en Ontario, encontraron que un 30% de las granjas fueron positivas al aislamiento de E. coli O149: K91: F4 (Amezcua et al., 2008). La bacteria ETEC O149: K 91: F4 ha sido el serogrupo predominante en la diarrea post-destete a nivel mundial (Fairbrother et al., 2005; Fontaine et al., 2002; Frydendahl, 2002). En un estudio caso-control realizado al sur de Ontario, este serogrupo fue el más común de las E. coli aislado en cultivos puros de cerdos con diarrea post-destete por E. coli. Además los serotipos O139: K82 y O138: K81 fueron también demostrados en algunos casos de diarreas post-destete por E. coli (Amezcua et al., 2002). E. coli patogénicas porcinas involucradas en la diarrea post-destete tipicamente pertenecen a los serogrupos O8, O138, O139, O141, O147, O149 y O157, de los cuales el serogrupo O149 es el más prevalente en la mayoría de los países (Noamani et al., 2003). Khac et al., (2006) encontraron que el serotipo más comúnmente detectado en cerdos con diarrea post-destete en Eslovaquia fue O149:H10 LT/STb/ESACI/F4. Interesantemente, este estudio demostró que dos nuevos serotipos (O163:H- y ONT:H4) han emergido como patógenos en cerdos en Eslovaquia. Además sus resultados muestran una alta diversidad genética principalmente entre las ETEC del serotipo O149:H10. Blanco et al., (2006) afirman que la distribución y frecuencia de serogrupos puede variar considerablemente de región a región y sobre el tiempo en una región dada. Lazo, (2007) plantea que los principales resultados obtenidos en su investigación muestran que en los procesos diarreicos por Escherichia coli que 13 afectan al cerdo durante la etapa neonatal y post-destete en diferentes granjas porcinas de la provincia de Villa Clara, Cuba, predominan los patotipos O141:H- TSa TSb VT2 y O157: H19 VT2. Además encontraron los serogrupos O7:H15 (1), O15:H45 (2), O15:H- (1), O20:H- (1), O35:H6 (2), O45:H9 (1), O64:H- (2), O84:H- (1), O149:H23 (1), O169:H38 (1), ONT:H19 (3), ONT: H- (2). Adicionalmente, este autor concluye que los aislados de E. coli a partir de muestras provenientes de cerdos con diarrea en la población estudiada, muestran una gran diversidad genética. Este autor encontró genes de virulencia para F18 y 987P (F6), no encontrando genes que codificaran para los antígenos de adhesión F4, F5, F17 y F41. Blanco et al., (1997) en un total de 74 cepas de E. coli aisladas de cerdos con diarrea o enfermedad edemática en España, encontraron una mayor prevalencia de genes que codifican para TSb (58 cepas), seguido por los que codifican para TSa (46 cepas), TL (19 cepas), VT2 (11 cepas) y VT1 (1 cepa). Estos autores concluyen que aparentemente en España hay tres seropatotipos predominantes, O149: K91: H10 K88+ TL-I+ TSb, O141: K 85ab: H- 987 P- TSaP+ y O138: K81: H14 o H- TSa+ VT2e. Thomas et al., (1998), plantean que la enterotoxina que se identifica con mayor prevalencia en las cepas de E. coli enterotoxigénicas en porcinos es la TSb, sin embargo las cepas TSb+ frecuentemente expresan además otras enterotoxinas como TL o TSa por lo que se ha sugerido que las cepas de E. coli que contienen solo TSb y no otra enterotoxina, son menos patógenas, lo cual fue demostrado experimentalmente por este autor en cerditos neonatos. Parma et al., (2000) encontraron en un estudio realizado en Argentina en 223 cerdos de 28 granjas porcinas, que el gen enterotoxigénico TSIa fue el más comúnmente encontrado en las cepas de ECET aisladas de cerdos con diarrea (27/127, 21.2 %), en comparación con TLI (4/127, 3.1 %) y 8 serogrupos O diferentes fueron encontrados, O8, O9, O64, O101, O138, O139, O149, y O162, siendo el más común el O164. Souza et al., (2001) demostraron por métodos de PCR, que el 70% de E. coli aisladas de cerdos con ED en Brasil portan los genes de Stx2e (por sus siglas en Inglés), y que el 83% de las cepas Vt2e+ resultaron positivas a los genes que codifican para la fimbria F18ab. Lazo, 14 (2007) el 100% de las cepas Stx2e aisladas resultaron positivas a los genes que codifican para las fimbrias F18 ab. En estudios realizados en Cuba por Talavera (1981) en 145 cepas de E. coli aisladas de cerdos lactantes con diarrea de dos unidades porcinas, halló como serogrupos más relevantes O141, O26, O157, O17, O137 y O126, siendo el serogrupo O141 y el O17 los que mostraron mayor frecuencia de aislamiento. Barreto y Karadjov (1985) quienes hallaron como serovariantes dominantes los serogrupos 0139 y 0149 en un estudio realizado en 127 cepas de E. coli aisladas en tres unidades porcinas afectadas por diarrea, en la Provincia de Camagüey. Harel et al., (1991) hallaron los serogrupos O149 y O157 entre los más comunes en Norte América, todos productores de TL y TSb. Woodward et al. (1993) encontraron que los grupos más comunes hallados en Australia son O9, O20 y O101. Alexander (1994) demostró que los serogrupos más comunes asociados a la diarrea en cerdos en el Reino Unido son O8, O138, O147, O149 y O157. Garabal et al., (1996) en un estudio de cinco años, realizado en España, hallaron los serogrupos O5, O7, O45, O141, O149 y O157 en cerdos con diarrea. Además, el 91,2 % (249 de 273) de ECET (TL y/o TSa). Parma et al., (2000) encontraron mayor prevalencia del serogrupo O64 en cepas ECET y O138 en ECET/VT en cerdos con diarrea en Argentina, y reportaron la baja incidencia de la toxina TL (3.1%) y un 21.2 % de TSa. Las cepas de E. coli aisladas de cerditos con diarrea neonatal son mucoides, a menudo no hemolíticas, y usualmente confinadas a los serogrupos O8, O9, O20, O64 y O101 (Fairbrother, 1999). Estas cepas han sido clasificadas como ETEC atípicas “Clase 2”, como ellas poseen adhesinas fimbriales pertenecientes a F4, F5, F6, o F41 y son generalmente toxina termolabil negativa (LT-, por sus siglas en inglés) y toxina termoestable posiva (ST+) (Harel et al., 1991). Históricamente, el antígeno de colonización F4 (K88) ha sido incriminado como el tipo de fimbria predominantemente asociado a la diarrea neonatal y postdestete en cerdos. Sin embargo, ha sido detectada una más alta prevalencia de cepas F18 comparada con F4 en diarrea postdestete y enfermedad edemática (Frydendahl, 2002; Cheng et al. 2004) en la República Checa, 15 detectaron 312 cepas positivas (40%) para F18 de 772 aislados de E. coli de cerdos destetados con diarrea, y VuKhac et al., (2006) detectaron un 35% de F18 de 101 aislados de E. coli de cerdos con diarrea postdestete en este mismo país. Hide et al., (1995) en Australia observaron que E. coli que expresaban F18, aislados de cerdos destetados pertenecían a los serogrupos O8, O45, O138, O141, y O157. También Alexa et al., (1995) y Nagy et al., (1999) mostraron que muchas cepas de ETEC y STEC halladas en la República Checa y Hungría, aisladas de cerdos destetados, expresaban F18 y eran predominantemente de los serogrupos O138, O139, O141, y O157. Lazo (2007) identificó el gen F18 en cepas de los serogrupos O35, O141 y O157. Como hallazgo en este estudio, fue observado asociación de F18 con toxinas, ya que los aislados de E. coli positivos para el gen F18, portan también TSa, además de toxinas TSb y Stx2e, Stx2e solo, o TSb solo. Rippinger et al., (1995) afirman que la adhesina fimbrial F18 está asociada a cepas aisladas de cerdos con diarrea postdestete y enfermedad edemática. Ojeniyi et al., (1994) y Frydendahl (2002) reportaron respectivamente, la detección de F18 en 34% y 39% de E. coli aislada de diarrea postdestete en Dinamarca. Un pesquisaje realizado por Hide et al., (1995) demostraron que de 480 aislados de E. coli hemolíticas de cerdos destetados con diarrea, un porcentaje significativo (62%) portaban el gen F18. También Wittig et al., (1995) mostraron la presencia de F18 en 75% de 380 E. coli aisladas del contenido intestinal de cerdos destetados con diarrea. Sin embargo, en algunos países ha sido encontrada una baja prevalencia de F18. En este sentido, Osek et al., (1999) en Polonia detectaron solo 10 (3%) cepas F18+ de 372 aislados de E. coli de cerdos con diarrea postdestete. Kwon et al., (2002) hallaron solo 19% de positividad para el gen F18 en 230 cepas de E. coli aisladas de diarrea postdestete en Corea. Blanco et al., (1997) plantea, que Escherichia coli enterotoxigénico (ETEC) y Escherichia coli verotoxigénico (STEC) son las principales categorías de bacterias que causan infecciones entéricas en cerdos. Las fimbrias F4 (K88) y F18 han sido implicadas como factores de colonización en la Diarrea Postdestete (Frydendahl, 2002; Cheng et al., 2004). Mientras la 16 fimbria F18 ha sido asociada además exclusivamente con la Diarrea Postdestete, la fimbria F4 (K88) ha sido también el principal factor de colonización implicado en la Diarrea Neonatal (Noamani et al., 2003). Lazo (2007) no detectó ningún aislado F4 (K88)-positivo, a pesar de ser uno de los factores de colonización más frecuentes en las cepas de ETEC causantes de diarrea neonatal y postdestete en todo el mundo. Contrariamente, en estudios realizados en Cuba, por Felix et al., (1981) empleando aglutinación rápida en placa, hallaron un 34% y 14,8% de E. coli K88+ y K99+ respectivamente, en 156 muestras de intestino delgado de cerdos con diarrea neonatal. En estudios realizados por Talavera (1981) empleando el método de aglutinación, encontró un 54.2% de cepas K88+ y 67,08% de cepas K99+ en 250 colonias aisladas de 25 cerdos lactantes que presentaban diarrea. Talavera (1983) halló alta prevalencia de aislados positivos, con el empleo de la prueba de inmunofluorescencia directa para la detección de E. coli K88 y K99. En otras unidades porcinas del país, Talavera (1982) aisló E. coli en cerdos sanos y diarreicos que expresaban antígenos fimbriales K88 y K99, encontrando mayor prevalencia de aislados positivos en cerdos con diarrea. Por otra parte Barreto y Karadjov (1985) en un estudio realizado en 127 aislados de E. coli de cerdos diarreicos con uno a tres semanas de nacidos, en tres unidades porcinas de la provincia de Camagüey, hallaron solo cuatro aislados (3,1%) que presentaban el antígeno K88 y uno (0,7%) los antígenos K88 y K99. Talavera y Montes de Oca (1987) al emplear la aglutinación rápida en placa, informaron de la detección de un 24,7% y 43,9% de positividad a fimbrias K88 y K99 en 105 muestras de copro y 41 de yeyuno respectivamente, procedentes de cerdos diarreicos al diagnosticar diarrea enterotóxica en tres laboratorios del país. Yanes et al., (1983) empleando esta misma técnica de diagnóstico, hallaron 14,8% y 9,2% de E. coli K88+ y K99+ respectivamente, en 54 aislados de E. coli de cerdos con diarrea neonatal. Pedroso y Talavera (1983) con el empleo de la inmunofluorescencia directa para el diagnóstico de E. coli K88 y K99 en cerdos diarreicos y no diarreicos, hallaron un 50 y 48% de antígenos enteropatógenos K88 y K99 respectivamente en E. coli aisladas de 50 cerdos diarreicos, y 17 concluye que esta prueba tiene mayor poder de detectabilidad que la aglutinación rápida en placa y tiene un valor diagnóstico presuntivo. Por otra parte, Pernas y Roja (1985), hallaron 16 (14,1%) y 9 (7,9%) de E. coli K88+ y K99+ respectivamente, de un total de 113 cepas de E. coli aisladas del intestino delgado en cerdos diarreicos de dos unidades de la Provincia de Villa Clara, al realizar un diagnóstico serológico con la prueba de aglutinación rápida en placa. En esta misma Provincia, Pernas y Bravo (1986) hallaron 50(28,9%) y 24(13,8%) cepas de E. coli K88 y K99 respectivamente de un total de 173 aislamientos en muestras de intestino delgado de cerdos que presentaban diarrea, mediante la prueba serológica de aglutinación en placa. Pernas et al., (1986) en 54 cepas de E. coli aisladas de cerdos con diarrea, encontraron solo 8 (14,81%) de K88+ y 5 (9.25%) de K99+. Lazo et al., (1988) en una granja porcina de la Provincia de Villa Clara, en 74 aislados de E. coli de cerdos con diarrea neonatal, hallaron 27 (36,4%) de K88+ y 2 (15,3%) de K99+ en cerdos con diarrea post-destete. Por otra parte Benitez et al., (1989) de un total de 83 E. coli aisladas en cerdos diarreicos de la misma unidad, encontraron 17 (20,4%) de K88+ y 19 (22,8%) de 987P. En un estudio realizado por Basulto et al., (1997) en granjas porcinas de la Provincia de Camagüey, emplearon un sistema inmunoenzimático ELISA y sondas de ADN específicas en la identificación de los genes que codifican los antígenos fimbriales K88, K99, F41 y 987P en 117 aislamientos de E. coli de cerdos con diarrea. Diez aislamientos resultaron positivos con las sondas utilizadas 5 (K88+), 4 (987P+) y 1 (K99+). En este estudio, hallaron que 4 (5,2%) de los 77 cerdos neonatos investigados, estaban infectados con E. coli portadoras del gen para la fimbria 987P y el 13 % de los cerdos neonatos analizados resultaron ser portador de E. coli K88+. Castro et al., (2002) en un total de 109 aislados de cepas de ETEC 54 (49,54%) fueron identificados como K88, K99, 987P o F41 empleando un ensayo inmunoenzimático ELISA. En este estudio el antígeno de colonización más común encontrado fue el F4 (K88) el cual fue hallado en el 70,32% de los cerdos, seguido por F6 (987P) 33,33%, F5 (K99) 25,92% y F41 24,07%. Otros autores Vu Khac et al., (2006) encontraron que ECET positiva para fimbria F4 (K88) fueron las más prevalentes aisladas de 18 cerdos neonatos (detectada en 38%) y DPD (detectada en 19%) en Slovakia. Ojeniyi et al., (1994); Alexa et al., (2002); Wittig et al., (1995); y Osek, (1999a) reportaron una prevalencia de aislados F4 (K88) originando diarrea postdestete en Dinamarca, República Checa, Alemania y Polonia de 26%, 19%, 14% y 19% respectivamente. Similarmente, Nagy et al. (1990) reportaron un 61% de aislados positivos con fimbria F4 (K88) de un total de 205 aislados de E. coli derivados de casos fatales de diarrea postdestete o enfermedad edemática en Hungría. Sin embargo, al igual que en este estudio, Pernas et al., (1980) hallaron un bajo porcentaje (0-16%) de los plásmidos de virulencia K88, K99 además del Ent en 192 cepas de E. coli aisladas del intestino delgado de 146 cerdos lactantes y 46 postdestetados con diarrea en esta misma provincia. En la Provincia de Camagüey, otros autores, Pernas et al., (1989) hallaron una baja incidencia de K88+ y K99+ (9,7 y 6,3% respectivamente) en aislados de copro y 28,5 y 11% de K88+ y K99+ respectivamente, en aislados de órganos de cerdos diarreicos con diarrea neonatal y diarrea post-destete, pero con el empleo de la prueba de aglutinación rápida en placa. En otras latitudes geográficas como Japón y Corea, también ha sido reportado una baja prevalencia de F4 (K88) aisladas de cerdos con diarrea post-destete (Kwon et al., 2002). Númerosos estudios demostraron que serogrupos O asociados con la fimbria F4 (K88) fueron principalmente: O8, O149, y O157 (Frydendahl, 2002). En España, O149:H10: TL/TSb y O157: H-: TL/TSb son los seropatotipos más prevalentes detectados en cepas ETEC F4 (Blanco et al., 1997). La ETEC F4+ está ampliamente expandida y es altamente prevalente en granjas de cerdos no vacunados. Van den Broeck et al. (1999) encontraron que el 65% de las granjas no vacunadas destinadas a la producción de cerdos en cuatro provincias de Bélgica fueron seroposivas a IgG contra F4, aunque la mayoría solo fue débilmente positiva. En ausencia de vacunación, la IgG sérica específica para F4 es inducida por infección con ETEC F4+. Hampson et al., (1987) observaron que ETEC hemolíticas pueden estar como residentes del tracto intestinal de cerdos lactantes saludables jóvenes que pueden excretar y expandir la bacteria. Por tanto, ETEC F4+ puede circular sobre granjas incluso 19 sin brotes clínicos de colibacilosis entérica. Sobre una escala regional, la prevalencia de ETEC F4+ en granjas no vacunadas es incluso más alta en West- Vlaanderen, Oost- Vlaanderen, y Antwerpen con 79, 71 y 68% respectivamente. El incremento de la seropositividad F4, con incrementadas densidades de granjas criadoras de cerdos, indica la importancia de la densidad de la población porcina sobre la prevalencia de infecciones en una región. Una vez que las infecciones por ETEC son transmitidas por contacto directo con las heces o materiales contaminados con heces, estos datos prueban el alto estándar de higiene que se necesita en las granjas especialmente en áreas con altas densidades poblacionales (Van den Broeck et al., 1999). La colibacilosis entérica porcina es un enfermedad de importancia en la provincia de Villa Clara, Cuba, con mayor ocurrencia en los meses de abril, junio, septiembre y diciembre y una estacionalidad manifiesta en el último cuatrimestre del año; con una prevalencia focal de periodo de 25,17% en la colibacilosis y de 58,74% en la colienterotoxemia, con una morbilidad de 50,92%, una mortalidad de 14,77% y una letalidad de 29,02% (Lazo, 2007). Wong et al., (1996) en la provincia de Camagüey, Cuba, al evaluar los parámetros de morbilidad y mortalidad por E. coli en crías y precebas, tomando como referencia los datos registrados en 1991,1992 y 1993, anteriores a la aplicación de un programa de vacunación, encontraron valores de morbilidad de un 13% en ambas categorías; y una mortalidad de un 7% en las crías. Estudios a cerca de la diarrea post-destete por E. coli F4+ se han focalizado mayormente sobre los síntomas clínicos de los cerdos (Madec et al., 2000), y no en la transmisión de la E. coli F4+. Sin embargo, para entender la epidemiología de la diarrea post-destete y para el desarrollo de medidas de control, información sobre infecciosidad y susceptibilidad de los individuos a E. coli F4+ dentro de una población es también necesaria. La excreción de E. coli F4+ en las heces puede reflejar diferencias en colonización y replicación entre cerdos, y por ende, diferencias en infecciosidad (Engel et al., 2003). Además de los niveles de bacteria excretada, otros aspectos como tolerancia al ácido (Merrell y Camilli 2002), supervivencia de E. coli F4+ en heces (Kudva et al., 1998) y 20 comportamiento de la enfermedad en cerdos son probablemente los que afectan la infecciosidad. La intensidad de la diarrea puede ser también un vector para la expansión de E. coli F4+, una vez que las heces diarreicas pueden formar aerosoles, aunque la toma oral pueda ser menor. Uno de los factores que causa alta variabilidad en la colonización y replicación y de esa manera en la excreción y diarrea, es la presencia o ausencia de receptores F4. La presencia de receptores F4 estuvo significativamente asociada con alta excreción de E. coli F4+ a gran escala. Esto indica que las poblaciones de cerdos Receptores F4+ y F4- no pueden ser consideradas homogeneas con respecto a la excreción de E. coli F4+. Por tanto, el estatus Receptores F4 de los cerdos y su efecto en las poblaciones serán tomados en cuenta en la evaluación de los modelos de infección de E. coli F4+ o cuando se van a probar medidas de intervención sobre E. coli F4+ (Geenen et al., 2006). González y Garabal (1998) señalan que la causa principal de la aparición de la colibacilosis en cerdos, está estrechamente asociada, a diferentes factores predisponentes; como destetes bruscos, cambios cualitativos y cuantitativos en la dieta, así como un manejo zootécnico inadecuado. Las dietas influyen sobre la capacidad de absorción del intestino y hacen al mismo más propenso a la colonización y subsecuente diarrea (Thomson, 2001). Lazo (2007) la mayor mortalidad aparente, pudieran atribuirse fundamentalmente a causas predisponentes relacionadas con la cantidad y calidad del alimento consumido en la etapa, la cual se caracterizó, por inestabilidad en el suministro de alimentos concentrados y mala calidad de las materias primas. La contaminación del agua de bebida juega un papel importante como fuente y vía de transmisión de la enfermedad (Lazo, 2007). Otro factor importante que incidió negativamente en el incremento de la tasa de morbilidad y mortalidad en las granjas afectadas, lo constituyó, la deficiente existencia de fármacos y productos desinfectantes, unido a la carencia de rodenticidas e insecticidas que limitaron la efectividad en las medidas contraepizoóticas relacionadas con los tratamientos curativos y el saneamiento ambiental. 21 Clostridium perfringens. Epidemiología. La enteritis necrótica en los cerditos lactantes está constituyendo un serio problema en las unidades debido al alto grado de morbilidad y mortalidad de la enfermedad. Considerado como un agente causal primario se encuentra Clostridium perfringens tipo C, el cual produce una serie de toxinas que juegan un papel importante en le patogénesis de esta enfermedad (Springer y Selbitz, 1999). Clostridium perfringens tipo C es causante de la enteritis hemorrágico- necrotizante y causa común de mortalidad aguda en lechones en los primeros días de nacidos y entre las 2da. y 4ta. semanas de vida; puede llegar a afectar hasta el 50% de la población total de la camada y cursar con una mortalidad de hasta el 100%. Se establece una toxiinfección que atraviesa la mucosa intestinal y se produce la toxemia. Altera la permeabilidad de los vasos, y lo más importante, produce una lesión necrótica en el intestino que incapacita a los lechones para absorber los alimentos. Producto de esto se origina rápidamente sangre en el interior del intestino y por consiguiente la muerte de los lechones de entre 12 horas y 7 días de edad. La muerte resulta del efecto directo de la bacteria que daña el intestino y permite la invasión de la toxina (Germán et al., 2005). En la infección por Cl. perfringens tipo C cabe destacar la existencia de cuatro formas clínicas: sobreaguda, aguda, sub-aguda y crónica. • En la forma aguda los animales suelen sobrevivir al menos dos o tres días desde el inicio del cuadro clínico y el cuadro patológico es prácticamente idéntico al observado en la forma sobreaguda. • En la forma sub-aguda los lechones presentan una diarrea no hemorrágica persistente y suelen morir a los 5-7 días de vida. El cuadro macroscópico es relativamente característico ya que se observan membranas necróticas en la mucosa intestinal con apariencia de jirones. • En la forma crónica aparecen lesiones similares a la forma sub-aguda observándose la lesión en áreas multifocales. También puede ocurrir enteritis debido a Cl. perfringens tipo A, que cursa sin sangre. 22 Signos clínicos Los cerditos afectados parecen normales al nacer, pero pueden enfermarse en el primer, o usualmente, en el segundo día de vida (36 horas luego del nacimiento) y usualmente mueren a las 12-24 horas del comienzo de los signos clínicos de la enfermedad. Una rara alta mortalidad (acercándose al 100% de los animales) y heces acuosas siempre sugieren la presencia de una enterotoxemia causada por Clostridium perfringens tipo C. Una diarrea dramática y profusa ocurre y rápidamente comienza a colorearse de sangre, los cerditos comienzan a sentirse débiles, colapsan y mueren. Diarreas neonatales de los lechones Los mecanismos por los que los patógenos entéricos inician la diarrea en porcinos están bien caracterizados. Sin embargo, la patogénesis de la enfermedad entérica es de origen multifactorial y a menudo requiere tanto del compromiso de las defensas del hospedador como el agente infeccioso: por ejemplo, la inoculación a cerdos con un agente infeccioso no suele ser suficiente para reproducir la enfermedad clínica en los estudios de investigación, gracias a la barrera de defensa en el tracto gastrointestinal (Moecer, 2009). La diarrea es una manifestación clínica y una de las enfermedades complejas más comunes en los cerdos alrededor del mundo. Es una consecuencia de las citadas patologías entéricas y ha sido un problema potencial debido a los grandes índices de mortalidad y morbilidad, ocasionando grandes pérdidas económicas (Morris et al., 2002), incluyendo a nuestro país (IMV, 2008). Además, las diarreas de los cerdos pueden traer otras implicaciones para la sociedad, primeramente debido a que algunas de las enfermedades entéricas porcinas son zoonosis y pueden ser transmitidas al hombre a través del contacto directo o a través de la contaminación del medio ambiente o por la ingestión de productos cárnicos provenientes de estos cerdos (Jacobson, 2003). Las diarreas neonatales, es decir, las que aparecen en los 2-3 primeros días después del parto, siguen siendo una patología importante en la cría de cerdos. Éstas han evolucionado considerablemente, observándose una regresión muy 23 clara de las diarreas "clásicas" provocadas por Escherichia coli, el virus de la Gastroenteritis Transmisible (GET) o Cl. perfringens Tipo C (Le Guennec, 2005). Hay 2 géneros de clostridios que pueden estar implicados en las diarreas neonatales, considerándose como los principales patógenos en los cerdos: Clostridium perfringens Tipo A y C y Clostridium difficile (Songer, 2005). Las infecciones entéricas producidas por Clostridium perfringens tipo A y C suelen aparecer durante el período de lactación de los lechones recién nacidos o de 4-6 días de edad cuando dejan de tomar el calostro, afectando principalmente el intestino delgado. Sin embargo, no se descarta la posibilidad de infección en cerdos de engorde en fase de acabado (Riopérez & Rodríguez, 2005). En los lechones lactantes, las diarreas de origen bacteriano son las mas comunes, entre ellas se encuentra la causada por el Clostridium perfringens Tipo A, el cual a pesar de ser parte de la flora intestinal normal, se ha reportado como agente causante de enteritis a partir de la primera semana de vida. Yaeger (2002) plantea que la diarrea de lechones por Clostridium perfringens Tipo A se asocia con la presencia de la toxina beta-2. La bacteria (Gram-positiva y anaerobia) se adhiere a las células epiteliales de las vellosidades intestinales, residiendo libremente en el lumen del intestino delgado, por lo que no produce lesiones y si una diarrea secretora. Se determina como responsable del 47-48 % de las diarreas de lechones neonatales de dicho estudio (entre las 12 horas y las 48 horas de vida del lechón). Como su nombre lo indica, este tipo de diarreas afecta a lo animales en las primeras etapas de la vida de estos, específicamente en los lechones. En el caso de la causada por Clostridium perfringens, además de los daños, anteriormente planteados, causados por las toxinas, la bacteria se adhiere a las células epiteliales de las vellosidades intestinales, residiendo libremente en el lumen del intestino delgado, por lo que no produce lesiones y sí una diarrea secretora (Straw et al., 2006). Se han realizado estudios para detectar la presencia de Clostridium perfringens tipo A y su enterotoxina en lechones lactantes con diarrea en edades comprendidas entre 1 y 15 días y relacionar los posibles hallazgos 24 histopatológicos encontrados en el intestino delgado e intestino grueso con la presencia de la enterotoxina de dicha bacteria. La investigación realizada confirma la presencia de Clostridium perfringens tipo A enterotoxigénico, asociado a diarreas en lechones lactantes entre 1 y 15 días de edad en granjas porcinas, aunque en lo que más coinciden los autores es que la diarrea en cerditos pequeños es un problema complejo, resultante de la interacción entre uno o varios agentes infecciosos, la inmunidad de los cerditos y los procedimientos de manejo, los cuales pueden favorecer la implantación del enteropatógeno o agravar sus manifestaciones (Morin et al., 1983). Hoy en día asistimos más bien a un "Síndrome de Diarrea Neonatal" en el que se producen importantes fallos o semi-fallos terapéuticos. La repercusión económica está vinculada sobre todo a la elevada morbilidad, que acarrea retrasos del crecimiento, mientras que la mortalidad es por lo general limitada. La organización del trabajo también se resiente, ya que los problemas aparecen sobre todo los viernes-sábados-domingos, con el consiguiente aumento de trabajo e intervenciones sobre los animales del fin de semana. El diagnóstico es cada vez más complejo con la acción de los clostridios en particular. Las medidas terapéuticas eficaces son todavía escasas y difíciles de trasladar de una explotación a otra. Las prácticas de la granja también son factores importantes e incluso determinantes en la aparición de la diarrea (Le Guennec, 2005). El diagnóstico del agente causal no es sencillo debido a la complejidad etiológica de estos procesos, descritos actualmente como síndromes. Las causales pueden ser bacterianas, virales, parasitarias y metabólicas. Dentro de los fundamentales está indudablemente Clostridium perfringens, junto a otras causas como E. coli, Coronavirus, Rotavirus y Coccidios (Morin et al., 1983 y Straw et al., 2006). En un estudio realizado en cerditos con diarrea se detectan virus en el 60% de las muestras, bacterias en el 23% y coccidios en el 15,3%. Dentro de los virus, el más comúnmente encontrado con una prevalencia de un 52% fue el de la Gastroenteritis Transmisible (GET); Rotavirus fueron implicados en un 9,2% y Adenovirus fue el de menos prevalencia con sólo un 0,30%. En el 25 caso de las bacterias, E. coli enteotoxigénica se detectó en un 22,4% de las muestras mientras que Clostridium perfringens tipo C fue encontrado ocasionalmente y la especie de Coccidio que se identificó fue Isospora suis (Morin et al., 1983). Las enteritis necróticas debidas a Clostridium perfringens tienen como base una mala higiene en los parideros y una vez que se presenta en los lechones es fatal. La única forma de prevenir este problema es a través de medidas de higiene. Muchos son los sistemas de manejo sanitarios o métodos que se implementan para evitar la mortalidad en esta fase crítica de la vida del cerdo, pero hasta el momento los esfuerzos para evitar este problema han estado encaminados hacia la prevención y control ya que resulta muy difícil la erradicación total (Quiles, 2004). Clostridium perfringens El organismo Clostridium perfringens fue identificado primeramente en 1892 por Welch y Nuttall y desde entonces se ha conocido por una serie de nombres incluyendo Bacillus perfringens, Bacillus welchii y Clostridium welchii. El Clostridium perfringens es un bacilo anaerobio y Gram positivo, formador de esporas ovales y subterminales. A diferencia con otras especies del género es relativamente de tamaño grande (0.6−2.4 x 1.3−9.0 µm), son encapsulados y no mótiles. Estas esporas no se producen en los medios de cultivos ordinarios (HPA, 2007). Las colonias se presentan con una morfología suave, redondeadas y brillosas, rodeadas por una zona interior de completa hemólisis causada por la theta- toxina y otra zona exterior de una hemólisis incompleta causada por la toxina alfa. (Quin et al., 1994). Presenta un fenotipo negativo a catalasa/oxidasa y positivo a la lecitinasa (en placas de agar con yema de huevo); y es buen reductor de sulfitos, observándose las colonias negras en placas de agar Shahidi-Ferguson perfringens (SFP) (Allen et al., 2003). 26 Cl. perfringens es clasificado como anaerobio, sin embargo la bacteria es capaz de sobrevivir y ocasionalmente llegar a crecer en presencia de oxígeno (Quin et al., 1994) y (Johansson et al., 2005). El crecimiento ocurre en un amplio rango de temperaturas, puede crecer desde los 12°C hasta los 50°C. Bajo las condiciones óptimas, las cuales se encuentran entre los 43°C y los 47°C, Cl. perfringens crece extremadamente rápido, con un tiempo de generación de 8-10 minutos y el crecimiento es acompañado por una abundante producción de gas. Además crece en un rango de pH entre 5 y 8. Un aspecto importante a la hora de tratar con Clostridium perfringens es tener en cuenta sus características de crecimiento y germinación. En un estudio realizado por de Jong et al., (2004) plantean que la bacteria es capaz de crecer a bajas temperaturas, cercanas a los 3ºC, análisis microscópicos de células creciendo a 15ºC revelan un cambio morfológico, se aprecian más alongadas que las que crecen a 37ºC. Además obtuvieron una germinación de las esporas con o sin activación con calor y a todas las temperaturas estudiadas (Morin et al., 1983). Clostridium perfringens puede sobrevivir bajo condiciones extremas, gracias a la diferenciación de sus células vegetativas, denominadas endosporas, las cuales les confiere una elevada resistencia (Paredes-Sabja, et al., 2008; Ando & Tsuzuki, 2008). Las endosporas bacterianas son los tipos de células de mayor resistencia que se conozcan, ellas pueden sobrevivir bajo condiciones extremas, son resistentes al calor, a la desecación, a los ácidos, a la luz UV y a muchos de los desinfectantes químicos existentes (Straw et al., 2006). Propiedades genéticas Entre las especies clostridiales toxigénicas, Clostridium perfringens es una especie paradigma para los estudios genéticos, debido a su tolerancia al oxígeno, a su alto grado de crecimiento y a su habilidad para la manipulación genética (Johansson, 2006). En el 2002 fue publicado el genoma completa de Clostridium perfringens Cepa 13 (Shimizu et al., 2002). El cromosoma de esta cepa consiste en 3,031,430 pares de bases, 2,660 regiones codificadoras de 27 proteínas y genes 10 rRNA, mostrando un contenido de G+C de un 28,6 %. En este propio estudio se detectó una gran variedad de genes relacionados con la toxicidad de Clostridium perfringens lo cual contribuye al conocimiento de su poder patogénico. Otras dos cepas de Clostridium perfringens se han secuenciado en el Instituto de Investigaciones Genómicas, la cepa ATCC 13124 y la SM 101. Un estudio comparativo de los tres genomas revela una considerable diversidad genómica con más de 300 “islas genómicas” únicas, las cuales codifican genes que correlacionan las diferencias en la virulencia y las características fenotípicas de estas cepas. Diferencias significativas entre estas cepas incluye numerosos elementos móviles nuevos y genes que codifican para diversas habilidades metabólicas como factores de esporulación, para el polisacárido capsular extracelular, para toxinas y otras enzimas secretadas, proporcionando nuevos conocimientos para entender a este patógeno bacteriano (Myers et al., 2006). Grupos Toxinogénicos de Clostridium perfringens Clostridium perfringens es la especie que más comúnmente es aislada a partir de diferentes medios. De ella, cinco grupos toxinogénicos (A, B, C, D y E) son identificados, los cuales son diferenciados en base a su capacidad de producir las cuatro letales exotoxinas antigénicas principales y una enterotoxina. (Jubb, 1990): alfa (α), beta (β), épsilon (ε) e iota (ι) (Koneman et al., 1997). En la tabla No. 2 se pueden apreciar la distribucción de estas toxinas con los tipos toxigénicos de Clostridium perfringens. Tabla No. 2: Tipos toxigénicos de Clostridium perfringens (Jubb, 1990) 28 La mayoría de las enfermedades clostridiales entéricas importantes de los animales domésticos se producen en los herbívoros y son causadas por uno u otro de los cinco tipos toxigénicos de Clostridium perfringens. El Clostridium perfringens tipo A es el más común de los cinco, su toxina principal es la alfa y es uno de los agentes productores de gangrena gaseosa en los seres humanos y en los animales. La producción de gangrena gaseosa en las infecciones de heridas o puerperales probablemente es un efecto compuesto de las toxinas principales y secundarias elaboradas por el microorganismo (Jubb, 1990). Según Songer (1996), los biotipos B, D y E son esporádicamente aislados del tracto intestinal de algunos animales por lo que vamos a referirnos solamente a los biotipos A y C, los cuales tienen una mayor importancia epidemiológica en las producciones porcinas, por ser los que con mayor frecuencia se han aislado de cerdos con síntomas clínicos como diarrea, enterotoxemia o enteritis necrótica (Yoo et al., 1997). Toxinas de Clostridium perfringens Alrededor de 17 exotoxinas de Clostridium perfringens han sido descritas en la literatura, pero definitivamente sólo las llamadas cuatro mayores toxinas descritas anteriormente, más otras no menos importantes desempeñan un rol protagónico en la patogénesis de las enfermedades clostridiales (Jubb, 1990). En la tabla No. 3 se muestran las principales enfermedades, en correspondencia con el tipo toxigénico y la/las llamadas principales toxinas que producen, que se le atribuyen a Clostridium perfringens. 29 Tabla No. 3: Principales enfermedades causadas por Clostridium perfringens en relación con los biotipos y las toxinas que producen. Tipo Mayores toxinas Enfermedades Tipo A Alfa Mionecrosis, intoxicación alimentaria, necrosis enteritis en aves, enterotoxemia en bovinos y ovinos, enterocolitis necrotizante en cerditos, colitis equina, gastroenteritis hemorrágica canina. Tipo B Alfa, Beta, Epsilon Disentería en ovinos recién nacidos, enteritis crónica en ovinos adultos, enteritis hemorrágica en terneros neonatos. Tipo C Alfa, Beta Enteritis necrótica en humanos, enteritis necrótica en aves, enterotoxemia hemorrágica o necrótica en cerditos neonatos, ovinos, terneros, caprinos. Tipo D Alfa, Epsilon Enterotoxemia en ovinos y caprinos, enterocolitis en cabras neonatos y adultos. Tipo E Alfa, Iota Enterotoxemia en ovinos y caprinos, enteritis en conejos. Clostridium perfringens es una bacteria única, no sólo en términos del número de toxinas que es capaz de producir, sino también en términos de su toxicidad y su actividad letal (Johansson, 2006). En la tabla No. 4 se muestra la actividad biológica de cada una de las toxinas, así como la localización en el genoma de cada uno de los genes que codifican para ellas. Como se aprecia, la mayor cantidad de genes toxinogénicos no se encuentran en el cromosoma de la bacteria sino que son genes plasmídicos, sugiriendo un potencial de movilidad y la subsecuente transferencia genética entre diferentes cepas de Clostridium perfringens (Bueschel et al., 2003). La toxina alfa (α), considerada la principal toxina letal de Clostridium perfringens, es una fosfolipasa multifuncional y se produce en cantidades variables en la mayoría de los aislados de Clostridium perfringens (Johansson, 2006). De hecho, es producida por todos los toxinotipos, mientras que la producción de las 30 demás principales toxinas, la beta (β), épsilon (ε) e iota (ι) marcan la diferencia para la denominación de Clostridium perfringens en los tipos B-E. Esto es determinado a la presencia del gen cpa, codificador de la toxina alfa (α), en todos los toxinotipos y el mismo se encuentra localizado en el cromosoma de la bacteria, mientras que los demás toxinogenes se encuentran localizados en grandes plásmidos virulentos (Petit et al., 1999). La toxina alfa (fosfolipasa C) es una lecitinasa de 43 kD que puede hidrolizar la lecitina en fosforilcolina, diglicerina y una hemolisina tiol activada (q-toxina o perfringolicina O). La toxina alfa (α) rompe la membrana celular de los eritrocitos, glóbulos blancos y células musculares, produciendo hemólisis o necrosis en las células (Lorber, 1995) logrando causar una mortalidad próxima al 50% de los animales (Riopérez & Rodríguez, 2005). La toxina beta es una proteína altamente sensible a la tripsina, causante de necrosis mucosal, enteritis necrótica en los lechones y daños en el Sistema Nervioso Central de numerosos animales domésticos (Riopérez & Rodríguez, 2005). Aunque los efectos de esta toxina han sido descritos se plantea que se debe continuar el trabajo para dilucidar de forma concreta el mecanismo de acción de la misma (Johansson, 2006). La toxina épsilon es una potente toxina responsable de diversas enterotoxemias letales en diferentes animales domésticos (Songer, 1996). Su mayor actividad se ha estudiado en ovinos, donde causa disturbios neurológicos graves cuando se encuentra en elevadas concentraciones en la circulación, con un curso clínico desde agudo, sobre agudo, hasta llevar a la muerte (Finnie, 2004). Tiene actividad necrotizante y letal; y se plantea que es una de las toxinas clostridiales más potentes luego de las neurotoxinas causantes del botulismo y el tétano, aunque su mecanismo de acción específico no se encuentra muy bien dilucidado (Johansson, 2006). Un trabajo de purificación y caracterización de la toxina iota (ι) demuestra que la misma es una toxina binaria, compuesta por dos proteínas, un componente activo (ia) y una proteína de unión (ib). Cada uno de los cuales aparece como un polipéptido simple cuando son determinados por SDS-PAGE y son diferentes en 31 cuanto a su estabilidad térmica. La actividad biológica de ia es estable a 85°C durante 15 minutos mientras que ib se inactiva a 55°C. No obstante, para desarrollar su actividad biológica, la toxina iota requiere de ambos componentes proteicos. Dicha toxina se ha encontrado incrementando la permeabilidad vascular y en dosis altas causando necrosis y muerte en ratones. Además actúa intracelularmente a diferencia de las otras toxinas de Clostridium perfringens, las cuales interactúan con las membranas celulares (Petit et al., 1999). Tabla No. 4: Actividad biológica de las principales toxinas Clostridium perfringens. Toxina Gen Localización del gen Actividad biológica Toxina alfa (α) cpa Cromosoma Citolítica, hemolítica, necrotizante, letal. Toxina beta (β) cpb1 Plásmido Citolítica, necrotizante, letal. Toxina épsilon (ε) etx Plásmido Edema en varios órganos: hígado, riñón y SNC. Toxina iota (ι) iap Plásmido Interrupción de la actina del citoesqueleto y la integridad de barrera celular Toxina beta2 (β2) cpb2 Plásmido Citolítica y letal. Enterotoxina (CPE) cpe Cromosoma/Plásmido Citotóxica, letal, causa diarrea por pérdida de agua e iones. Toxina theta pfoA Cromosoma Lisis de glóbulos rojos y modula la respuesta inflamatoria del hospedero. Fuente: Petit et al., 1999 Otra de las potentes toxinas producidas por Clostridium perfringens es la enterotoxina (CPE) codificada por el gen cpe, el cual se ha encontrado indeterminadamente localizado en el cromosoma de aislados del tipo A (sobre 32 todo en intoxicaciones alimentarias en el hombre según Collie y McClane, (1998) o en un plásmido cuando los aislados se obtienen de enfermedades en animales (Sparks et al., 2001) y posee una alta estabilidad en un gran rango de temperaturas, incluso por debajo de 0ºC (Li & McClane, 2007). Esta enterotoxina es una proteína de 34,000 Da de peso molecular y es un componente estructural de las esporas de Clostridium perfringens. Se encuentra asociada a enfermedades gastrointestinales de los cerdos, actuando sobre la mucosa del tracto intestinal, causando secreción de fluidos y electrolitos en el íleum de los mismos, aunque no es muy común encontrarlo causando enfermedades en animales (Collins et al., 1989). También el gen cpe se ha aislado en humanos causando diversas enfermedades gastrointestinales, sobre todo en casos de intoxicaciones alimentarias (Heikinheimo et al., 2004; Fernández et al., 2005; Heikinheimo et al., 2006; Smedley et al., 2007). La producción de la enterotoxina es co-regulada con la esporulación, la toxina se libera cuando se someten a lisis las células vegetativas (Johansson, 2006). Otra de las proteínas extracelulares es la toxina theta o perfringolisina O, una citolisina formadora de poros que puede provocar lisis de los glóbulos rojos y junto con la toxina alfa modula la respuesta inflamatoria del hospedero, causando acumulación de leucocitos dentro de los vasos sanguíneos y la prevención de la afluencia normal de células fagocíticas en los tejidos infectados del hospedero (Johansson, 2006). Consideraciones para el Diagnóstico Diferencial Existen varios agentes que pueden confundir el diagnóstico de la enfermedad, por presentar estos, signos muy semejantes a los que causa Clostridium perfringens. Por ejemplo, se plantea que la presencia de diarrea acuosa en los lechones causada por Clostridium perfringens Tipo A o Tipo C puede ser confundida con la que se presenta debido a una Gastroenteritis Transmisible, Diarrea Epidémica, Rotavirus, o E. coli., pudiendo actuar estos agentes de forma independiente o en asociación (Le Guennec, 2005). 33 La diarrea característica causada específicamente por Clostridium perfringens tipo A, y por causa de esto es que en ocasiones se hace muy difícil el diagnóstico, se confunde con las presentadas en los casos de infecciones con Brachyspira pilosicoli o Salmonella. Además, debido a que Clostridium perfringens es naturalmente encontrado formando parte de la flora normal del intestino de muchos animales (Songer, 1996; Le Guennec, 2005); incluso del hombre (Fernández et al., 2005; Heikinheimo et al., 2006); la identificación de la bacteria no es suficiente para un diagnóstico efectivo. El diagnóstico de la enterotoxemia se basa usualmente en los signos clínicos y patológicos encontrados pero la demostración de las toxinas en las muestras fecales y en el contenido intestinal se hace necesaria para confirmar un diagnóstico (Niilo, 1987; Uzal, 2004). Un número de técnicas serológicas y moleculares han sido utilizadas para identificar las toxinas de Clostridium perfringens; incluyendo técnicas inmunoelectroforéticas (Uzal et al., 2003; Johansson et al., 2006), técnicas de immunodifución, diferentes tipos de ELISA’s (Uzal et al., 1997; Hale & Stiles, 1999; Uzal et al., 2003; Carvalho et al., 2006; Wasiński, 2007), aglutinación en látex (Collins et al., 1989; Martin & Naylor, 1994) y una que no ha tenido grandes ventajas como la seroneutralización en ratones y cobayos (Yoo et al., 1997). Actualmente se ha generalizado el uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (por sus siglas en Inglés) (Kanakaraj et al., 1998; Warren et al., 1999; Augustynowicz et al., 2002; Bueschel et al., 2003; Baums et al., 2004; Kalender & Ertaş, 2005; Jost et al., 2006; Shinya et al., 2006; Czanderlova et al., 2006; Johansson et al., 2006; Wasiński, 2007; Das et al., 2009). Por ejemplo, el ELISA se ha usado por los laboratorios de diagnóstico de enterotoxemias, especialmente en casos de brotes de enfermedades o en casos de muertes en las instalaciones porcinas. Este método es muy simple, confiable, de costos limitados y brinda resultados cuantitativos ( ver el manual de kits ) . Este método puede se utilizado para la determinación de toxinas y el diagnóstico diferencial de los tipos de Clostridium perfringens implicados en las enterotoxemias porcinas (Koç & Gökce, 2007). 34 Con todo esto, en el 2004 se plantea por Uzal que el diagnóstico de las infecciones por Clostridium perfringens en animales es complejo y sería apropiado contar con una combinación de técnicas de diagnóstico en lugar de un solo test (Uzal, 2004). Rotavirus. Epidemiología La afectación de los cerdos de forma natural es usualmente menos severa que la experimental debido a las defensas que le aporta la madre a las crías mediante el calostro. Por lo general la infección por rotavirus es endémica afectando a una gran cantidad de granjas porcinas, por lo que una gran parte de las cerdas tienen inmunidad lo que les permite transmitirla a sus crías. Los niveles de anticuerpos contra rotavirus disminuyen rápidamente en el calostro por lo que la enfermedad aparece cuando la carga viral supera al nivel protectivo de las defensas adquiridas por los lechones. Las prácticas de manejo que perturban la transferencia de defensa a los cerditos (factores que afecten la lactación) y los niveles de contacto rotavirus-cerdo en las granjas (higiene y tipo de crianza), afectan la edad de presentación y severidad de la diarrea por rotavirus (Ward et al. 1996). La dieta tiene una importante influencia en la aparición de la enfermedad pues cerdos alimentados con dietas secas pueden no presentan síntomas clínicos de la enfermedad, sin embargo animales alimentados con dieta líquida desarrollan diarrea cuando se enfrentaron al virus (Yuan, et al. 2006). La diarrea asociada a rotavirus de forma natural se ha reportado en cerdos de 1 a 41 días de edad, lactantes o dentro de los primeros 7 días de destetados. La enfermedad sin complicaciones en cerditos lactantes usualmente es resuelta entre 2 y 3 días. Las heces son blanco-amarillentas, desde líquidas a pastosas y con cantidad variable de flóculos. La morbilidad usualmente es inferior al 20% y la mortalidad de menos del 15%, aunque es mayor en cerdos muy jóvenes. La diarrea por rotavirus en cerdos lactantes es frecuentemente complicada con Isospora suis o E. coli enterotoxigénica, lo cual resulta en un agravamiento del cuadro clínico aumentando la morbilidad y mortalidad. 35 La importancia del rotavirus en cerdos destetados es menor aunque se conoce que tiene gran importancia como agente primario en la producción de diarreas graves asociado a Gastroenteritis Transmisible o a E. coli enterotoxigénica. La inoculación a cerdos destetados con rotavirus o E. coli enterotoxigénica no produjo enfermedad alguna o muy leve sin embargo la inoculación de ambos agentes resultó en una gran colonización por la E. coli y una diarrea grave (Melin et al. 2004). Los rotavirus son ubicuos en el ambiente por lo que es difícil encontrar planteles porcinos libres de los mismos en las condiciones de crianza usuales. Se han encontrado afectando al cerdo varios grupos de rotavirus (A, B, C y E) y de los grupos A y C varios serotipos (Martella et al. 2007). El grupo A de rotavirus es más frecuentemente encontrado en cerditos de menos de 60 días de edad, tan temprano como en la primera semana de edad, aunque la prevalencia más elevada es entre las semanas 3 a 5 de vida de los animales. La prevalencia de la infección aumenta con la edad durante el periodo de lactancia debido a que disminuyen los títulos de anticuerpos adquiridos por los cerditos en la lactancia. Cuando la inmunidad pasiva adquirida de la madre disminuye a niveles que no protegen a los animales, estos se hacen susceptibles a padecer diarrea por rotavirus. Los cerdos afectados eliminan rotavirus en las heces con un promedio de duración de 7.4 días (Martella et al. 2006). En la infección por grupo B de rotavirus la eliminación de las partículas virales es en menor cantidad y menos tiempo. El grupo C de rotavirus produce diarreas en cerdos destetados entre 8 y 9 semanas de edad con un rango de morbilidad del 60% al 80% pero con baja mortalidad. Del grupo E de rotavirus ha sido reportado solo un brote de diarrea en cerdos pertenecientes al Reino Unido (RU), pero la infección experimental en cerdos gnotobióticos produce una diarrea leve. Un estudio serológico en el Reino Unido indicó una amplia distribución de anticuerpos contra este grupo viral en cerdos de más de 10 semanas de edad (Martella et al. 2006a). La prevalencia de los rotavirus grupo A en cerdos diarreicos puede estar entre el 20% y el 70% mientras que en cerdos 36 asintomáticos puede ser menor del 5%, por otra parte los grupos atípicos (B y C) presentan una prevalencia de alrededor del 10% (Alfieri, 2004; Polanco, et al. 2004). La prevalencia serológica de los distintos grupos de rotavirus es distinta en dependencia de las regiones mundiales y de la edad de los animales. Los métodos genéticos moleculares (northern-blot, dot-blot hibridación y Reverso Transcriptasa Reacción en Cadena de la Polimerasa [RT-PCR]) han ayudado a definir mejor la distribución de los tipos G y P del grupo A de rotavirus en cerdos. Los principales tipos G que se han determinado son G3, G4, G5, G11, aunque los tipos humanos G1, G2 y los tipos bovinos G6, G8 y G10 han sido también detectados en cerdos. Los tipo P más comúnmente identificados son P2B[6], P9[7]; otros genotipos P como P[8] y P[6] así como los genotipos P bovinos P[1], P[5] y P[11] han sido detectados en cerdos (Barmana et al. 2006; Martella et al. 2007). El rotavirus es eliminado por las heces fecales por lo que la principal vía de transmisión es la fecal-oral. Sin embargo algunas investigaciones muestran que cerdos gnotobióticos inoculados con una cepa patógena de rotavirus humano por vía respiratoria y oral eliminaron similares títulos nasales y fecales por 3-4 días. Los rotavirus pueden ser detectados por igual en el polvo y en las heces secas provenientes de lugares que han sido ocupados por cerdos jóvenes. Estos mantienen la infectividad en heces por 7-9 meses a temperatura ambiente así como en heces almacenadas a 10 ºC por 32 meses. La persistencia de rotavirus favorece un mecanismo para la exposición constante de los cerdos (Yuan, et al. 2006). Los rotavirus son resistentes a la inactivación por varios desinfectantes químicos y antisépticos, pero pueden ser inactivados por desinfectantes como fenol, formalina, cloro y β-propiolactona. El etanol, quizás el desinfectante más efectivo, ejerce su efecto removiendo la cápsula externa. Los desinfectantes que contienen etanol, lechadas de hipoclorito de sodio y productos a base de fenol reducen efectivamente la concentración de rotavirus entre un 95% y 99% después de 10 minutos de tratamiento (Yuan, et al. 2006). 37 Muchos estudios han dado evidencia de transmisión de rotavirus entre especies (cerdo-bovino, cerdo-caballo y cerdo-humano). Rotavirus aislados de cerdos diarreicos han tenido especificidad típica de grupo G y P de rotavirus bovino, indicando una función patogénica para el rotavirus bovino en cerditos. Algunos estudios proponen que cepas de rotavirus circulantes en una especie animal pueden ser un riesgo para otras si existen las condiciones adecuadas. Otros autores plantean una posible transmisión del virus porcino a los caballos. Muchos autores presentan fuerte evidencia de que el rotavirus porcino puede cruzar la barrera interespecies y producir gastroenteritis en humanos (Laird et al. 2003; Varghese et al. 2004; Esona et al. 2004; Mukherjee et al. 2009). La patogenia del rotavirus es compleja y la forma de inducción de la diarrea presenta varios mecanismos. La mala absorción que se produce por la pérdida de las células absorbentes como resultado de la atrofia vellosa es el mecanismo más aceptado por el cual el rotavirus produce diarrea en cerdos. Estudios recientes han sugerido que las respuestas inflamatorias intestinales, la activación del sistema nervioso entérico y la función de enterotoxina del rotavirus NSP4 también contribuyen a la diarrea secretora y la infección por este virus (Estes, 2001; Kordasti et al. 2006; Martin-Latil et al. 2007). El rotavirus se replica predominantemente en el citoplasma de las células epiteliales diferenciadas de las vellosidades del intestino delgado y en las células epiteliales del ciego y colon. El virus se replica más extensivamente en el yeyuno e ileon. Verticalmente los antígenos de RV han sido observados en casi todas las células epiteliales vellosas en el yeyuno e ileon y en menos células epiteliales en las puntas vellosas en el duodeno. La replicación de los rotavirus en los enterocitos ciliados resulta en lisis celular y la consecuente atrofia vellosa. El grado de atrofia vellosa y la distribución de las vellosidades atróficas en el intestino delgado varían en relación a la cepa, serogrupo de RV y la edad de los cerdos. En general, la atrofia vellosa es más severa y extensa en cerdos más jóvenes. Los RV grupo A y C tienden a inducir atrofia vellosa y diarrea más severa que los grupos B y E en cerdos. El grupo B produce los focos 38 diseminados de infección en las puntas vellosas del intestino delgado distal y la diarrea leve (Lorrot y Vasseur, 2007). Los cerditos que desarrollan diarrea luego de la inoculación con RV humano o porcino demostraron alteraciones funcionales en las células epiteliales vellosas del intestino delgado, incluyendo daños en el transporte de sodio-glucosa, disminución en la actividad de la disacaridasa y un incremento en la actividad de la timidin-kinasa. Estos cambios fisiopatológicos contribuyen a la diarrea por mala absorción. La malnutrición incrementa la severidad y duración de la diarrea por RV mediante el retardo en la capacidad enzimática y de absorción, así como obstaculizando la regeneración de las vellosidades intestinales dañadas, lo cual resulta de gran importancia para el manejo porcino (Lorrot et al. 2006). En inoculaciones experimentales la aparición de diarrea precede a la atrofia vellosa sugiriendo que otros mecanismos actúan en la producción de la misma. La inflamación intestinal estimula el sistema nervioso digestivo y en ratones esto puede provocar hasta 2/3 de la diarrea. La inflamación puede también provocar daños en la mucosa permitiendo la colonización bacteriana o el paso de toxinas a la sangre, aumentando la permeabilidad de la mucosa a las macromoléculas y facilita la entrada de toxinas a las células, haciendo más susceptibles a los cerdos a infecciones bacterianas por esta vía que permitiendo la colonización de la mucosa (Lorrot y Vasseur, 2006). NSP4 fue reconocido como enterotoxina viral contribuyendo a la patogénesis de la diarrea por rotavirus en ratones. NSP4 induce diarrea dependiente de la dosis y la edad, induciendo un aumento de la concentración de Ca2+ en el citoplasma celular y salida de Cl- y agua al medio extracelular, actuando de forma similar a los toxinas producidas por la Shigella y el colera. Péptidos provenientes de esta proteína que son liberados por las células activan el sistema nervioso entérico provocando la diarrea explicada anteriormente (Ramig, 2004, Lorrot y Vasseur, 2006; Seo et al. 2008) Existen factores que pueden aumentar la posibilidad de muerte de un cerdito afectado por RV como la baja temperatura ambiental, malnutrición y exposición a altas dosis de virus. La diarrea causa deshidratación y desbalance electrolítico 39 y puede llevar al agotamiento de las reservas de fluidos extracelulares, requiriendo tratamiento oral con electrolitos. La mala absorción resulta en mal nutrición y puede llevar a deficiencia energética e hipotermia, la cual puede ser aliviada empleando fuentes externas de calor a los cerditos y tanto líquido de rehidratación como sea necesario. La elevada mortalidad observada en cerditos neonatos está más relacionada con la atrofia vellosa extensa y severa conjuntamente con una disminución del líquido extracelular y reservas de energía, comparados con cerdos ligeramente mayores (Lorrot y Vasseur, 2007). En la infección por rotavirus se localizan las lesiones principalmente en el intestino. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la infección sistémica por RV no es tan infrecuente en los animales y el hombre, incluso el cerdo (Blutt, et al. 2006, Blutt, et al. 2007). Diagnóstico El diagnóstico requiere la detección del virus, antígeno viral o RNA viral. Los rotavirus pueden ser considerados como una causa de diarrea en cerdos neonatos de 1 a 8 semanas de edad. Las muestras fecales, contenido intestinal o secreciones deben ser recolectados en la fase aguda de la enfermedad y enviados al laboratorio. El RV es eliminado a las concentraciones más elevadas en las primeras 24 horas de la aparición de la diarrea. El muestreo durante este periodo de tiempo es especialmente crítico para la detección de cierto grupo de RV porque la aparición, cantidad y duración de la eliminación del virus es menor en cerdos infectados con el grupo B (Yuan, et al. 2006). Varios métodos pueden ser utilizados para la detección de RV, incluyendo microscopía electrónica (ME), inmuno ME (IME), inmunohistoquímica, inmunofluorescencia (IF) en secciones congeladas o láminas de impresión de intestino delgado, ELISA, aislamiento viral, aglutinación latex, dot-blot hibridación, electroferotipificación de RNA, Reacción en Cadena de la Polimerasa en Reverso Transcriptasa (RT-PCR) y RT-PCR cuantitativo (RT- qPCR) (Gutiérrez et al., 2008). 40 La ME ha sido muy usada para el diagnóstico de rotavirus e incluso para resolver discrepancias en resultados de otras técnicas, esta es muy específica porque el RV tiene una distintiva morfología. Cuando el diagnóstico se hace a pocas muestras la más rápida técnica a usar es la ME porque las muestras se pueden teñir con ácido fosfotúngstico y examinarse directamente a los pocos minutos de recolectada la muestra. El uso de IME ayuda a la diferenciación de los serogrupos de RV (Zhang et al., 2008). El ELISA es frecuentemente usado para la detección de antígenos de RV en muestras de heces fecales o contenido intestinal. Según Santos et al. (2008), están disponibles paquetes de diagnóstico comercial para la detección de grupo A de RV y también han sido desarrollados ELISA con el uso de anticuerpos monoclonales (Mabs) para la detección de grupo B y C de RV. El uso de esta técnica diagnóstica es la más recomendada en la actualidad para los diagnósticos de rutina y la vigilancia de las diarreas agudas producidas por rotavirus en los hospitales porque es menos sensible que el RT-PCR y esto permite discriminar mejor a los verdaderamente enfermos ya que el RT-PCR detecta muy bajos niveles de RNA (Stockman et al. 2008). La electroferotipificación del RNA viral es usada para la detección y diferenciación de los grupos de RV ya que RV de diferentes grupos tienen distinto electroferotipo. Para esta técnica se aísla el RNA viral de las heces fecales, se hace una corrida electroforética en gel de poliacrilamida y se tiñe con plata para visualizar las bandas de RNA. Esta técnica se utiliza mucho en la actualidad debido a que detecta RV con una especificidad del 100% mediante electroferotipo de 11 bandas característico, se puede diagnosticar RV del grupo A y de otros grupos (B a G), que presentan una distribución de bandas características y para los cuales todavía no existen disponibles comercialmente kits de diagnóstico inmunológico, discriminando entre los distintos grupos de Rotavirus, aún de aquellos provenientes de distintas especies y las variaciones genómicas entre Rotavirus provenientes de la misma especie (Portella, 2003; Amarilla et al. 2005, Ferreira et al. 2006; Romero et al. 2007). 41 Las pruebas serológicas son de poca importancia en el diagnóstico de RV porque en la mayoría de las unidades porcinas los animales presentan títulos de anticuerpos contra RV. Sin embargo, los títulos de anticuerpos y los isotipos son indicativos del estado de inmunidad de los animales. Altos niveles de Inmunoglobulina (Ig) M o IgA son indicativos de activa o reciente infección por RV. Hay una variedad de técnicas para medir la respuesta serológica a la infección por RV incluyendo IME, Reacción de Fijación del Complemento, IF indirecta, hemoaglutinación (HA), ELISA, Neutralización Viral (VN), inhibición de HA, inhibición de la hemoaglutinación pasiva reversa y tinción inmunocitoquímica (Blutt et al., 2006; Blutt et al., 2007). ELISA utilizando Mabs específicos para los isotipos ha sido usada para detectar respuesta de anticuerpos IgM, IgA e IgG a los RV. La reducción en placa y ensayo de reducción neutralización fluorescente han sido usados para la detección de anticuerpos neutralizantes. Los ensayos de neutralización brindan una significativa información sobre la identidad de los RV y el desarrollo de la respuesta de los anticuerpos a los serotipos específicos (Azevedo et al. 2004). Los ensayos de hibridación de ácido nucleico son muy sensibles y específicos a la detección del RNA y genotipificación de RV, siendo más sensible que el ELISA para la detección de RV. El método de mayor sensibilidad y especificidad para la detección de RV y genotipificación de los grupos (A-C y E) es el RT- PCR. El RT-PCR múltiple es la mejor técnica para la determinación de grupos G y P de grupo A de RV. Esta técnica ha sido usada también para la detección de grupo B y C de RV. La recientemente desarrollada hibridación de oligonucleótidos ofrece otro método para la genotipificación de RV, esta prueba combina la alta sensibilidad del RT-PCR con la selectividad de la DNA-DNA hibridación, siendo capaz de identificar todos los genotipos de cepas de RV (Ferreira et al., 2006; Santos et al., 2008). 42 MATERIALES Y MÉTODOS. El trabajo se realizó en los laboratorios de Inmunología y Microbiología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas y en el Laboratorio de Proteínas del Instituto de Biotecnología de las Plantas, en la Provincia de Villa Clara, Cuba. En el presente estudio fueron sacrificados con fines diagnósticos 90 cerdos, con cuadros enteropáticos y clasificados en dos categorías (crías o precebas), teniendo en cuenta sus edades. A las crías corresponden los cerdos con edades comprendidas entre 0 y 25 días de nacidos y de 26 hasta 50 días de nacidos les llamamos precebas. Los cerditos sacrificados ni las madres fueron tratados con antibióticos. Los muestreos se realizaron entre las fechas del 15 de mayo y el 10 de junio del 2008, distribuidos sus cantidades por las unidades objeto de estudio como aparece en la siguiente tabla. Muestreos realizados en las diferentes unidades Unidad Identificació n Crías (0-25 días) Preceba (26-50 días) Total Salamina II A 9 6 15 Calabazar B 6 9 15 Charco hondo C 7 8 15 Negrito D 8 7 15 Remate E 7 8 15 Cordobanal F 7 8 15 Total 44 46 90 Diseño Experimental: El método de muestreo utilizado fue en Etapas Múltiples o Multinivel. Primeramente se seleccionaron a través del método aleatorio simple las seis unidades porcinas a muestrear. En cada Unidad se procedió a la selección de 43 una muestra de 15 animales diarreicos de las categorías crías y precebas. Esta selección se realizó alternando el tamaño de la muestra por categoría en cada Unidad Porcina, garantizando al final del muestreo 45 crías y 45 precebas, para un tamaño de muestra de 90 animales. El tamaño de la muestra se calculó según Pfeiffer (2002) para poblaciones infinitas y con un nivel de precisión de 99%. Características de los animales: Todos los animales objeto de estudio se encontraban en iguales condiciones zootécnicas, medioambientales y nutricionales, propias de su categoría y unidad. Características de las muestras: Se seleccionaron aquellos cerditos que presentaban diarreas acuosas, espumosas, amarillentas y en algunos casos grisáceas y viscosas, en ninguno de los casos se observaron signos hemorrágicos leves ni agudos. Se tuvo en cuenta este aspecto debido a que Straw et al., (2006) plantearon que en los casos sub-agudos de la enfermedad la diarrea es no hemorrágica y los animales pueden encontrarse activos, alertas y con apetito; signos que comienzan a disminuir progresivamente hasta que adelgazan y se pueden deshidratar a medida que se acercan a la muerte y en los casos crónicos, estos signos ocurren de forma similar pero la diarrea puede presentarse de forma intermitente, pudiéndose alargar por más de unas semanas. Las muestras fueron transportadas con geles regrifrigerados y la conservacion a menos 20 para los kits de alicuotas de heces fecales. Investigaciones realizadas:  Hematología (parámetros hematológicos generales por métodos clásicos.  Glicemia. (Glucosa oxidasa. Helfa Diagnósticos).  Examen clínico (termometría). 44  Estudio bacteriológico del agua de bebida de la granja. Determinación del número más probable de coliformes totales en 100 ml de agua (NMP/100 ml de agua)  Diagnóstico parasitológico (Isospora suis) Otros protozoos y nemátodos. Por métodos clásicos: frotis fecal, flotación de Sheather’s, Mc Master Stoll, cultivo de ooquistes en bicromato de potasio.  Cryptosporidium parvum (das-elisa kit (Bio-X Diagnostic) KIT ELISA BIO K 070 para Cryptosporidium - Microplate cubierta con anticuerpo monoclonal - Agregar las muestras y el control positivo. Incubar 1 hora a 21 0C +/- 3 0C. Lavar - Agregar conjugado. Incubar 1 hora a 21 0C +/- 3 0C. Lavar - Agregar cromógeno mas sustrato. Esperar 10 minutos. Agregar solución de stop. Leer a 450 nm.  Diagnóstico de Rotavirus. Dot doublé antibody sandwich enzyme immunoassay for detection of rotavirus tipe A. Ingenasa. ELISA El inmunoensayo se realizó con el kit comercial 11rtk2 (Igezim rotavirus das) dot de IGANASA siguiendo las instrucciones del fabricante la cual describimos brevemente a continuación. Preparación de las muestras Se homogenizaron las muestras de heces fecales en diluente, se centrifugaron y colectó el sobrenadante. Procedimiento de la prueba Se añadieron 100µl de la muestra en cada pocillo de la placa, para agregar luego Anticuerpo Monoclonal-Biotina y Streptavidina-Peroxidasa y por último el sustrato antes de añadir la solución de parada en cada pocillo. Luego se leyó la absorbanci