Departamento de Ciencias Farmacéuticas Título: Metodología para el desarrollo de los estudios de seguridad toxicológica de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus con fines cosmecéuticos Autor: Yanielis Castillo Muguruza Tutor: MSc. Maibia Tamayo Irsula MSc. Yisel González Madariaga 2021 Academic Departament: Pharmaceuthical Sciences Title: Methodology for the development of toxicological safety studies of secondary metabolites extracted from Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus for cosmeceutical purposes Author: Yanielis Castillo Muguruza Thesis Director: MSc. Maibia Tamayo Irsula MSc. Yisel González Madariaga 2021 Este documento es Propiedad Patrimonial de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, y se encuentra depositado en los fondos de la Biblioteca Universitaria “Chiqui Gómez Lubian” subordinada a la Dirección de Información Científico Técnica de la mencionada casa de altos estudios. Se autoriza su utilización bajo la licencia siguiente: Atribución- No Comercial- Compartir Igual Para cualquier información contacte con: Dirección de Información Científico Técnica. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní. Km 5½. Santa Clara. Villa Clara. Cuba. CP. 54 830 Teléfonos.: +53 01 42281503-1419 EXERGO “No es el resultado de la investigación científica que ennoblece a los seres humanos y enriquece su naturaleza, sino la lucha por entender mientras realiza un trabajo intelectual, creativo y de mente abierta” Albert Einstein. DEDICATORIA A mi familia en general por apoyarme en todo momento de la carrera con buenos y alentadores consejos. AGRADECIMIENTOS A Dios porque me ha guiado en cada paso de mi vida. A mi tutora Maibia Tamayo Irsula por su dedicación, por brindarme sus conocimientos y habilidades, porque sin su ayuda no hubiera alcanzado mis objetivos. A todos los profesores de la carrera por la contribución en mi formación como profesional. A mi familia por su apoyo espiritual, por su confianza en todo momento. A mi novio por brindarme su fuerza y amor incondicional. A mi compañera y amiga Susana por su apoyo, consejos y ayuda en lo que necesitara. A todas aquellas personas que me ofrecieron sin dudar su ayuda. ¡A todos Gracias!!!!!!!!!!!! RESUMEN RESUMEN Desde su surgimiento, a mediados de la década de los 90, los cosmecéuticos irrumpieron con fuerza en el mercado de la estética profesional, lejos de convertirse en una moda pasajera, constituyen, según los analistas, el sector con mayor potencial de crecimiento de la industria cosmética. Sin embargo, pocos de estos productos están avalados por estudios de seguridad toxicológica. Por tal motivo esta investigación tiene como objetivo diseñar una metodología para el desarrollo de los estudios de seguridad toxicológica de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus con fines cosmecéuticos. Para el desarrollo de la investigación se analizan procedimientos normativos y documentos regulatorios para el registro de productos cosmecéuticos en Cuba, además, procedimientos normativos que rigen los estudios toxicológicos para comprobar la seguridad de los productos y, se establece la metodología para el desarrollo de los estudios de seguridad toxicológica de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana. Como resultados de la investigación se comprobó que los procedimientos normativos y registros analizados carecen de regulaciones para productos cosmecéuticos en Cuba y se confeccionó la metodología para el desarrollo de los estudios seguridad toxicológica de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus con fines cosmecéuticos. Palabras claves: Cosmecéuticos, seguridad toxicológica, Agave brittoniana Trel. regulaciones. Summary Summary Since their emergence, in the mid-90s, cosmeceuticals broke into the professional aesthetics market with force, far from becoming a fad, they constitute, according to analysts, the sector with the highest growth potential in the cosmetic industry. However, few of these products are supported by toxicological safety studies. For this reason, this research aims to design a methodology for the development of toxicological safety studies of secondary metabolites extracted from Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus for cosmeceutical purposes. For the development of the research, normative procedures and regulatory documents for the registration of cosmeceutical products in Cuba are analyzed, in addition, normative procedures that govern toxicological studies to verify the safety of the products and, it is established the methodology for the development of the studies of toxicological safety of secondary metabolites extracted from Agave brittoniana. As results of the investigation, it was found that the normative procedures and analyzed registries lack regulations for cosmeceutical products in Cuba and the methodology for the development of toxicological safety studies of secondary metabolites extracted from Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus was drawn up for cosmeceutical purposes. Keywords: Cosmeceuticals, toxicological safety, Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus, regulations. ÍNDICE INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………….. 1 I REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA………………………………………………………………. 5 1.1 Cosmecéuticos………………………………………………………………………………. 5 1.1.1 Surgimiento y desarrollo de cosmecéuticos obtenidos de especies vegetales. 5 1.1.2 Estudios para pruebas de eficacia y seguridad de cosmecéuticos de uso tópico 9 1.2 Estudios de seguridad toxicológica en la evaluación de especies vegetales…………. 13 1.2.1 Estudios toxicológicos agudos…………………………………………………….. 14 1.2.2 Estudios alternativos en toxicología………………………………………………. 14 1.2.3 Estudios de irritabilidad dérmica…………………………………………………… 18 1.2.4 Estudio de irritabilidad oftálmica…………………………………………………… 18 1.2.5 Estudio de toxicidad dosis repetida por 28 días…………………………………. 18 1.2.6 Estudios Toxicológicos en el Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus………… 20 1.3 Entidades regulatorias cubanas. Regulaciones vigentes……..…………………………. 20 2. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………………….. 27 2.1 Tipo y método de investigación……………………………………………………………….. 27 2.2 Contexto de la investigación………………………………………………………………….. 27 2.3 Diseño general de la investigación………………………………………………………….. 27 2.3.1 Consulta y análisis de documentos normativos y regulatorios vigentes, relacionados con los cosméticos en Cuba………………………………………… 27 2.3.2 Análisis de los procedimientos normativos que rigen los estudios toxicológicos para comprobar la seguridad de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus……………………………………………………... 28 2.3.3 Propuesta de una metodología para el desarrollo de estudios de seguridad toxicológica…………………………………………………………………………….. 28 3. RESULTADOS y DISCUSIÓN……………………………………………………………….. 30 3.1 Análisis del diseño general de la investigación…………………………………………….. 30 3.1.1 Consulta y análisis de documentos regulatorios para el registro de cosméticos. 30 3.1.2 Análisis de los procedimientos normativos que rigen los estudios toxicológicos para comprobar la seguridad de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus………………………………………………………………………………. 32 3.1.3 Propuesta de una metodología para el desarrollo de estudios de seguridad toxicológica ….…………………………………………………………………………. 33 CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………... 37 RECOMENDACIONES………………………………………………………………………………. 38 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………………………………... 39 ANEXOS INTRODUCCIÓN 1 1. INTRODUCCIÓN El auge de la cosmecéutica se enmarca en una tendencia a los tratamientos no invasivos de belleza antiedad que comenzó en Estados Unidos a mediados de los 90, gracias en gran medida a la labor de varios dermatólogos. Aunque el mayor desarrollo de los cosmecéuticos ha estado ligado a la demanda de productos antienvejecimiento, su potencial es mucho mayor: productos anticaídas, regeneradores, blanqueadores cutáneos, etc. Se trata, pues, de una cosmética más activa que se presenta como alternativa eficaz frente a tratamientos médicos más invasivos. (González Minero and Bravo Díaz 2017); (Padilla-Camberos, Flores-Valdés et al. 2018) Como los cosmecéuticos no tienen como finalidad la “cura, tratamiento o prevención de enfermedades”, se catalogan intrínsecamente como cosméticos.La cosmética sólo consigue ocultar, disimular o resaltar aspectos visibles de la piel o de la morfología de la misma y no son capaces de penetrar en el estrato córneo o más profundo para afectar a las células de forma efectiva, mientras que los dermacéuticos o cosmecéuticos con su elevada capacidad reconstructiva, sí lo hacen y actúan sobre los tejidos profundos de la dermis de una forma duradera. Muchos de los activos considerados como cosmecéuticos se encuentran también en cosméticos convencionales, pero en menores concentraciones. El reto del cosmecéutico es combinar de forma óptima eficacia con seguridad. En este sentido los laboratorios, han visto reducidos los excesivos requisitos y costes de las pruebas clínicas adicionales que implicaría su catalogación como medicamentos. (Padilla-Camberos, Flores-Valdés et al. 2018); (Trueba) Los cosmecéuticos, como cosméticos que son, deben emplearse exclusivamente de forma tópica, es decir, en zonas superficiales del cuerpo humano y con una finalidad estética sobre la piel sana. La formulación del producto ha de ser capaz de garantizar la integridad del activo hasta su liberación en la piel. El “vehículo” cosmético que se emplee puede potenciar la eficacia o hacer que sea totalmente inactivo. Es decir, el “diseño” cosmético es especialmente importante y complicado en el caso de los cosmecéuticos, de ahí que, en la mayoría de los casos, los cosmecéuticos presenten los principios activos encapsulados en liposomas de última generación o bien en emulsiones con efecto de liberación rápida 2 osostenida.Su compleja formulación, junto con su alta concentración de activos y las pruebas de eficacia y seguridad que se efectúan antes de su salida al mercado, hace que los cosmecéuticos sean más caros de elaborar, lo que suele repercutir en su precio final. (Fernández Ibarz 2020) Cuba potencia la fabricación de cosméticos con productos naturales, lo cual permite sustituir importaciones y minimizar el impacto del bloqueo económico, comercial y financiero impuesto por los Estados Unidos. La especialista Irela Pérez Sánchez, vicepresidenta del comité organizador del II Congreso Internacional de Estética, Cosmetología y Medicina Estética 2019, precisó que desde hace unos años varias instituciones y centros científicos del país trabajan en la creación de una extensa línea de cosméticos a partir del empleo de productos y sustancias obtenidas de la naturaleza. En este contexto sería una estrategia viable encontrar nuevos productos de origen natural con propiedades farmacológicas comprobadas y toxicológicamente seguras que pudieran representar blancos para futuras preparaciones como cosmecéuticos en dependencia de sus componentes químicos y sus actividades farmacológicas. La Unidad de Toxicología Experimental (UTEX), orientada a la evaluación farmacotoxicológica preclínica de nuevos productos, ha venido trabajando desde el año 2005 en el desarrollo de proyectos ramales e institucionales, dirigidos a comprobar científicamente actividades farmacológicas y toxicológicas en la especie Agave brittoniana T. y otras especies. En las primeras investigaciones referenciadas se evidenció que diferentes especies de Agave han mostrado, tanto in vitro como in vivo, actividad antinflamatoria, (Salazar Pineda 2017) antioxidante (Solano and Viridiana 2011); (Granados and Emiliano 2018) antidiabética, (Hernandez-Galicia, Aguilar-Contreras et al. 2002) hipolipemiantes (García- Curbelo, Ayala et al. 2018) y actividad citotóxica contra algunas líneas de célula cancerígena, (Mthembu and Motadi 2014); (Anajwala, Patel et al. 2010) entre otras. La especie Agave brittoniana es endémica de la región central. Las saponinas esteroidales son consideradas responsables de diferentes efectos farmacológicos. (Ramalingam and Kim 2016) La diosgenina, sapogenina presente en numerosas especies vegetales, incluida 3 el Agave brittoniana tiene demostradas actividades como hipolipemiante (Cayen and Dvornik 1979), antiinflamatoria (Pimentel, Lira et al. 2013); (Aravinthan, Kim et al. 2015); (Hassan, Sule et al. 2012) e hipoglucemiante. (Elekofehinti, Omotuyi et al. 2014) En modelos experimentales de síndrome metabólico el extracto hidroalcohólico y crudo de saponinas mostraron actividad antiobesidad, observándose disminución del peso corporal, la adiposidad visceral y los valores de triacilglicéridos (Águila Sánchez 2019). Las saponinas también fueron evaluadas en modelos de colitis ulcerosa, demostrándose efecto antiinflamatorio y cicatrizante. (Fernández Triana 2014). Estudios previos efectuados para evaluar efecto antiinflamatorio agudo y crónico demostraron efecto farmacológico de la especie. (Martín 2016); (Resino Ruiz 2018) El efecto hipolipidémico ha sido evaluado en modelo agudo de inducción de hiperlipidemia con detergente no iónico. En estos estudios se ha demostrado que diferentes extractos de la planta reducen los niveles de lípidos comparables a medicamentos como al ácido nicotínico. (Vizcaino Abreu 2017); (López González 2018). Estudios de seguridad toxicológica en la primera etapa han sido diseñados para evaluar el crudo de saponinas. En los estudios agudos a dosis límite de 300mg/kg no se apreciaron signos de toxicidad. Por otra parte, se evaluaron los test de genotoxicidad en eritrocitos de médula ósea y en reticulocitos de sangre periférica y en ninguno de los casos se clasifican como genotóxicos los extractos ricos en saponinas de esta especie, en dosis ensayadas superiores a las farmacológicas (Brunet Ramos 2017). No obstante, es indispensable para el uso de cualquier cosmecéutico demostrar su seguridad para garantizar que no irritan la piel y los ojos por lo que es recomendable establecer una guía metodológica que organice el desarrollo de los estudios toxicológicos y que a su vez sean consistentes con las exigencias regulatorias del país para registrar este producto. En este contexto se plantea como Problema Científico el siguiente: ¿Es posible establecer la metodología para el desarrollo de los estudios de seguridad toxicológica de Agave brittoniana Trel spp Brachypus con fines cosmecéuticos que sea consistente con las exigencias regulatorias del país para registrar este producto? 4 Para dar solución a este problema científico se plantea como Hipótesis: El diseño de una metodología para el desarrollo de los estudios toxicológicos del producto de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus permitirán evaluar su seguridad y además optimizar tiempo, recursos y cumplir con las exigencias regulatorias del país para el registro como cosmecéutico Los estudios de toxicología preclínica permitirán establecer la metodología para registrar con fines cosmecéuticos en Agencias Regulatorias Cubanas. Para cumplimentar la hipótesis planteada, se propone como Objetivo General: Diseñar una metodología para el desarrollo de los estudios de seguridad toxicológica de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus para su registro con fines cosmecéuticos. En correspondencia con la hipótesis y para dar respuesta a la problemática, se plantean los siguientes Objetivos Específicos: 1. Analizar documentos normativos y regulatorios para el registro de productos cosmecéuticos en Cuba. 2. Analizar procedimientos normativos que rigen los estudios toxicológicos para comprobar la seguridad de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus. 3. Establecer la metodología para el desarrollo de los estudios de seguridad toxicológica de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus con fines cosmecéuticos. REVISIÓN BIBLIOGR ÁFICA 5 CAPITULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Este capítulo pretende abordar aspectos significativos e importantes relacionados con los cosmeceúticos de origen vegetal (uso tópico), tales como su definición, historia, surgimiento y desarrollo, así como estudios tanto toxicológicos como farmacológicos, dentro de los que se encuentran los realizados a la especie Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus. Además, se referirán las entidades regulatorias en el mundo, enfatizando en las existentes en Cuba, así como en las regulaciones vigentes. 1.1 Cosmecéuticos 1.1.1 Surgimiento y desarrollo de cosmecéuticos obtenidos de especies vegetales El surgimiento de la cosmética se encuentra enmarcada desde las más remotas épocas de la prehistoria. En la etapa primitiva los jefes, hechiceros y las clases sociales más elevadas se distinguían por sus pinturas y adornos faciales. En Egipto cumplió un papel preponderante, dejando un amplio legado de frascos cosméticos encontrados en tumbas reales. También, Hipócrates conocido como el padre de la medicina, recomendaba baños aromáticos y masajes diarios. Además, en Roma Galeno se hizo famoso por su fórmula contra la piel seca y las arrugas hoy llamadas cold cream. (González Minero and Bravo Díaz 2017) En la Edad Media la pobreza, guerras y epidemias provocaron que la cosmética fuera casi abandonada, situación que poco a poco se fue revirtiendo gracias a las cruzadas en Oriente del siglo XI al XIII, lo cual originó un intercambio maravilloso de productos cosméticos de diferentes culturas. (González Minero and Bravo Díaz 2017) En la actualidad, se masificó su uso, encargándose la publicidad de alabar sus virtudes, con fotografías de rostros bellísimos de supermodelos, lo cual se ha establecido como patrones a seguir. Además, la liberación de la mujer, su introducción paulatina en el mundo laboral, y las modas, han hecho de la cosmética una auténtica necesidad. A partir de la década de los setenta los hombres entraron a formar parte de este culto a la belleza, utilizando lociones, tónicos para el cabello y desodorantes. El término cosmecéutico fue acuñado por Raymond Reed (miembro fundador de la Sociedad de Químicos Cosméticos de Estados Unidos) y popularizado por el Dr. Albert Kligman (médico dermatólogo). Fue definido como la unión de las palabras cosmética y 6 farmacéutica, los cosmecéuticos incorporan productos biológicos y/o naturales que actúan de forma efectiva sobre la piel, sobre su estructura y funcionamiento de una manera tópica; por tanto, no pueden ser ingeridos, inhalados, inyectados o implantados (Navarro Pérez 2016); (Padilla-Camberos, Flores-Valdés et al. 2018); (Anunciato and da Rocha Filho 2012). Sus ingredientes activos y niveles de concentración son notablemente superiores al de los cosméticos normales, mostrando así, que, aunque su finalidad a priori sea principalmente cosmética, sus ingredientes activos y su capacidad regeneradora van más allá de lo que podrían llegar a ser los productos cosméticos básicos. (Fang and Vangsness Jr 2020) Entre los ingredientes cosmecéuticos más utilizados podemos mencionar los péptidos biomiméticos, que imitan la acción de una proteína o enzima; los aminoácidos de colágeno, elastina y fibronectina; los fosfolípidos y ceramidas; los alfahidroxiácidos como el glicólico, el láctico y el cítrico; los betahidroxiácidos como el salicílico; el recientemente descubierto ácido lactobiónico, los factores de crecimiento provenientes de semillas, brotes y cultivos especializados; las células madre de cultivos especializados de uva, manzana o argán; los ácidosgrasos como el gama-linolénico, oleico y palmítico; las vitaminas C, E, A, carotenos y pantenol; los minerales como el cobre, zinc, calcio y hierro entre otros; y las enzimas de papaya y bromelina. (Fang and Vangsness Jr 2020); (Pinzón Campo) Destacar el desarrollo de estos, el cual ha estado ligado a la demanda de productos antienvejecimiento, pero se percibe que su potencial es mucho mayor (Padilla-Camberos, Flores-Valdés et al. 2018). No obstante, existe un gran avance en varias industrias para convertir y utilizar la mayor parte de los recursos vegetales en subproductos valiosos como ingredientes cosmecéuticos. En este sentido, Chile y otros países de Sudamérica se proponen desarrollar y validar el primer cosmecéutico antiaging con filtro solar natural, cuya formulación contiene una mezcla de extractos vegetales con actividad antioxidante demostrada de elaboración propia y que incluirá al menos 3 especies autóctonas chilenas: buddleja globosa, ugni molinae y geviuna avellana. También, la Asociación de Investigación de la Industria Textil (AITEX), la cual es una empresa privada, en el marco de su proyecto de investigación, ha realizado extracciones de activos cosméticos de varias especies vegetales: cúrcuma (antiarrugas), regaliz (función blanqueante), centella asiática (hidratante, cicatrizante, regeneradora) y 7 agave (antiarrugas); ha estudiado el rendimiento obtenido en cada uno de ellos, así como también ha realizado la encapsulación y formulación cosmética de estos. Mediante la extrusión y gelificación iónica (encapsulación de extractos) de algunos polímeros naturales, como el alginato y el quitosano, se han obtenido perlas cosméticas, como formato innovador y de gran atractivo visual, para proteger los activos con función antioxidante, antiarrugas y despigmentantes que contienen los extractos obtenidos. Además, Biodiverso, una Empresa de Base Tecnológica (EBT), donde también participa la Universidad Politécnica de Cartagena (UPCT), utilizan pulpas de frutas que se obtienen de productos hortofrutícolas con el objetivo de investigar, desarrollar y comercializar productos cosméticos y nutricosméticos. Encarna Aguayo Giménez, socia fundadora de Biodiverso, catedrática de la universidad y responsable de la Unidad de Calidad Alimentaria y Salud del Instituto de Biotecnología Vegetal de la UPCT, explica que todo arrancó comercializando 4 cremas corporales y exfoliantes, elaborados con pulpas de melocotón y naranja. En estos momentos dicha empresa, dispone de tres tipos de cremas faciales. 1. Crema facial hidratante: Contiene betaína obtenida de la remolacha que hidrata la piel en profundidad. Además, están formuladas con aloe vera ecológico. 2. Crema antioxidante: Utilizan el resveratrol y el extracto de las semillas de uva, obteniendo un producto antioxidante con alta concentración en polifenoles. 3. Crema antiedad: Incorporan la aceituna y hoja del olivo, cuyos componentes principales son el hidroxitirosol y el ácido maslínico (actividad antioxidante y antiinflamatoria). Incluye el lapacho, el cual ralentiza el proceso de envejecimiento y aumenta la longevidad de la piel. Estos ingredientes son combinados con otras frutas como pepino, lima, pomelo, kiwi, etc y los mejores aceites vegetales como jojoba, aguacate, argán, zanahoria, rosa mosqueta, etc. En la actualidad, en Cuba también se potencia la fabricación de cosméticos con productos naturales, que permiten su desarrollo y comercialización, en instituciones de alto prestigio. Esas entidades aprovechan para su elaboración algas marinas, quitina (un polímero extraído del carapacho de la langosta), quitosana (para la creación además de medicamentos), sábila, aceite ozonizado, extractos naturales, aloe y caléndula, entre otros. El Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC), utiliza el aceite ozonizado para 8 producir jabones duros para el tratamiento del acné y otros males de la piel. También el Centro de Investigaciones Marinas, de la Universidad de La Habana (UH) emplea algas marinas que arriban a las costas del archipiélago, con las cuales se elaboran extractos que luego son empleados por la firma Suchel Regalo para fabricar cosméticos que se comercializan en la red de tiendas de toda la nación. El Grupo Empresarial LABIOFAM se destaca en el uso del Vimang, que se emplea para mejorar la salud humana y la calidad de vida, con fines terapéuticos y cosméticos. (I 2019) El laboratorio de tecnología farmacéutica UNAN-Managua donde se realizó una crema cicatrizante (Cicatrimiel, uso tópico) empleando como principio activo la miel de abeja (Apis mellífera), con propiedades antibacterianas, antioxidantes, antiinflamatorias y cicatrizantes, la cual estimula los linfocitos y fagocitos induciendo a los marcadores moleculares a la reparación de tejidos y la activación de queratinocitos conllevando a la cicatrización de la piel. (Collado Urbina, Cruz Gómez et al. 2018) También se obtuvo por primera vez el aceite de Moringa oleífera ecotipo Plain, procedentes de la India suministradas por la Entidad de Ciencia Tecnología e Innovación “Sierra Maestra”. La investigación se desarrolló en las Facultades de Ingeniería Mecánica y Química de la Universidad Tecnológica de la Habana, “José Antonio Echeverría”, demostrándose que el aceite de moringa como principio activo es potente para utilizarse en la elaboración de cosméticos, además de ser hidratante, limpiador para la piel y tener poder antiinflamatorio. Siguiendo los procedimientos de Suchel Camacho con índices de calidad similares a productos comerciales, se formuló por primera vez a nivel de laboratorio la crema exfoliante con cáscara y aceite de Moringa oleífera ecotipo Plain. Basado en las propiedades antes mencionadas, se han elaborado también cremas antienvejecimiento, jabones, champús, acondicionadores y otros productos, que permiten ampliar esta industria y propicia una línea de productos con materia prima nacional (García 2018); (Gómez 2018); (Ferrer Serrano, Zumalacárregui de Cárdenas et al. 2020); (Marín 2015) Una cooperativa habanera desarrolló un producto natural obtenido de algas contra la soriasis hace 5 años. Hilda Hernández Domínguez, máster en Medicina Bioenergética, aclaró que el producto no es un medicamento, sino un fitocosmético que alivia la patología. Los Laboratorios habaneros Hada cuentan con una gama de geles, tónicos y cremas que ayudan a reducir las arrugas, celulitis y líneas de expresión del rostro y el cuello. 9 También, en el país se importa además maíz de Estados Unidos para su empleo como materia prima en la obtención de glucosa en la Unidad Empresarial de Base (UEB) Cienfuegos. En este proceso se genera el aceite de germen de maíz, como subproducto. Su empleo resulta muy conveniente en el diseño de formulaciones cosmecéuticas para aplicación en la piel. Además, la UEB Cienfuegos, en colaboración con la Universidad Central de Las Villas (UCLV), ha iniciado los estudios de este aceite, con vistas a su empleo como materia prima en las industrias cubanas de cosméticos, medicamentos y alimentos. También, en la UCLV se dispone de un cosmecéutico en forma de gel obtenido del extracto de Hojas de Jatropha gossypifolia L., pues constituye una forma farmacéutica, cosmética y cosmecéutica tradicionalmente empleada en el tratamiento del acné. 1.1.2 Estudios para pruebas de eficacia y seguridad de cosmecéuticos de uso tópico Los productos cosmecéuticos de uso tópico deben ser eficaces, ya que cualquier fabricante o comercializador de estos productos está obligado legalmente por el reglamento de cosméticos a aportar todas las pruebas necesarias que justifiquen las reivindicaciones presentes en cualquiera de estos productos. Además, la eficacia por vía tópica de cada principio activo en concreto no depende exclusivamente de su potencia farmacológica intrínseca, sino también de su capacidad para ser absorbido y alcanzar la lesión. Por tanto, la formulación desempeña un papel relevante a la hora de facilitar esta capacidad. También, resulta fácil entender, que el mismo principio activo puede tener una actividad claramente distinta al estar formulado en vehículos diferentes. Se realizan diferentes pruebas para comprobar la eficacia cosmética, las cuales abordan los distintos tipos de estudios y pruebas con las que se pueden sustentar los beneficios deseados de un producto cosmético. Dentro de estas destacan las siguientes: 1. Ensayo de eficacia de la conservación: Es la herramienta de la que dispone el microbiólogo, entre otras, para ajustar los conservantes a la concentración adecuada y demostrar que el producto será microbiológicamente seguro en las condiciones normales y previsibles de uso. Además, se emplea para saber si los conservantes son adecuados. 2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI): Pueden dar una idea de la mayor o menor eficacia de la sustancia frente a diferentes tipos de microorganismos. 10 Asimismo, el desarrollo de cosméticos para indicaciones específicas requiere de un estudio detallado de los ingredientes óptimos y su correcta combinación. Para ello, cada ingrediente aplicado a uso tópico es estudiado detallando su efecto y acción sobre la piel, para lograr así una eficacia demostrada. No obstante, los cosmecéuticos de uso tópico han de ser además seguros en condiciones de utilización normales, o razonablemente previsibles, respetando las normas de composición y etiquetado previstas. Pues existen herramientas de gestión de riesgo que se utilizan desde que se empieza su desarrollo, mediante las que se evalúan los ingredientes a ser usados conforme a los listados de referencia que existen, nivel de pureza y buenas prácticas de fabricación, se cuenta con controles de riesgos, que consideran el target de población a la que va dirigida el producto, cálculo del margen de seguridad de ingredientes, tomando en cuenta los niveles de exposición, frecuencia de uso, zona del cuerpo en la que se aplica y como se utiliza el producto, todo lo anterior, basados en guías internacionales. Igualmente, para garantizar la seguridad, de estos productos, los que se introduzcan en el mercado deben ser elaborados conforme a los principios de buenas prácticas de fabricación, siendo supervisado su cumplimiento por las autoridades nacionales. En fin, La seguridad de los productos cosméticos se basa en la evaluación de la seguridad de las sustancias que lo componen. Dentro de los requisitos a tener en cuenta para lograr su seguridad se encuentran: 1. Selección cuidadosa de los ingredientes, tratando que sean seguros a una concentración dada en un producto terminado. 2. Tolerancia local del producto terminado (chequeo). 3. Selección de un adecuado embalaje para mantener la calidad del producto y evitar tanto como sea posible riesgos de maltrato o accidente. 4. Control de calidad, principalmente microbiológico, también contaminantes químicos. 5. Aplicación de buenas prácticas de manufactura. 6. Rotulado apropiado. 7. Presentación del producto, instrucciones para uso y aplicación, precauciones (si corresponde) y acción a tomar en caso de accidente. 11 8. Procedimientos adecuados en caso de efectos adversos con productos comercializados, dermatológicamente y oftalmológicamente testeados, etc. Las materias primas y otros ingredientes utilizados en la preparación también deben seleccionarse adecuadamente, dependiendo de sus características utilizando diferentes técnicas analíticas, donde se deben evaluar los siguientes parámetros: 1. Evaluación de la seguridad de los materiales. 2. Determinación de propiedades fisicoquímicas. 3. Propiedades físicas: Medición del tamaño de partícula, forma, área y morfología superficial, superficie de carga, porosidad, cristalinidad y amorfo. 4. Propiedades químicas: Impurezas, composición química, solubilidad y revestimiento de la superficie. 5. Reevaluación de productos cosméticos después del lanzamiento. 6. Conceptos toxicológicos. 7. Ruta y exposición externa: Inhalación, ingestión y permeabilidad en la piel. 8. Captación y absorción 9. Estudios toxicológicos: Irritación dérmica, ocular, sensibilidad en la piel, foto toxicidad, mutagenicidad y genotoxicidad. (López Sánchez 2020) En cuanto a la seguridad de cualquier sustancia, se determina como evaluación del riesgo comúnmente aceptada la siguiente: 1. Identificación y caracterización del peligro: Consiste en identificar la toxicidad intrínseca de la sustancia (daño a la salud). Se basa en resultados de pruebas in vivo, ex vivo e in vitro, métodos in silico y extrapolación, estudios clínicos y epidemiológicos, informes de casos y datos de vigilancia luego de su comercialización. 2. Evaluación de la exposición: Se calcula en base a la función y uso declarados de la sustancia, a la cantidad presente en el producto y frecuencia de uso de este. La exposición única describe la exposición a un ingrediente cosmético en una categoría de producto por una sola ruta. La exposición agregada es la suma de exposiciones únicas, y describe la exposición para todas las categorías de producto en las cuales se utiliza el ingrediente cosmético y todas las rutas de exposición relevantes. Además, la exposición 12 en grupos más vulnerables de población puede evaluarse de forma separada si es necesario (bebés, embarazadas, etc). 3. Evaluación dosis-respuesta: Para evaluar la relación entre la exposición y la respuesta tóxica se determina el PoD. Este se define como el punto de dosis-respuesta que marca la máxima dosis de exposición de la sustancia a la cual no se observa un efecto adverso. Se calcula principalmente a partir de estudios de toxicidad sistémica, normalmente por vía oral. En la mayoría de las evaluaciones se ha utilizado el NOAEL (máxima concentración de sustancia a la cual no se observan efectos adversos) como PoD. Sin embargo, es posible usar otros parámetros como el LOAEL (Lowest-Observed-Effect- Level) o el BMD (Benchmark Dose). 4. Caracterización del riesgo: Este en el caso de los cosméticos, viene determinado por el Margen de Seguridad (MoS), y se determina mediante la división del PoD (numerador) y la Exposición sistémica o SED (Systemic Exposure Dose). (Sibaja 2002) En tal sentido, la caracterización del riesgo de todas las sustancias que componen un producto debe ser segura, es decir, que deben tener un MoS igual o superior a cien. De esta manera se ofrece la máxima protección, en términos de seguridad para la salud humana, al consumidor de productos cosméticos. Los respaldos para sustentar eficacia y seguridad son: 1. Ingredientes permitidos para cosméticos en listados oficiales: Aseguran que el producto no sea tóxico y pueda ser utilizado en la piel y sus anexos. Para poder respaldar una determinada acción cosmética presente en rótulos del producto, esta puede sustentarse mediante el hecho de poseer en su formulación uno o más ingredientes que respalden dicha función. 2. Estudios de eficacia cosmética realizados al producto: Análisis de carácter cuantitativo o cualitativo que permite evaluar el desempeño del producto en función de la promoción cosmética. 3. Bibliografía de carácter científico que respalde la función cosmética: Es la información proveniente de fuentes científico-técnicas que proveen datos o información relevante y pertinente para el soporte de las promociones cosméticas. Además, se incluyen los estudios realizados en ingredientes por proveedores. 13 4. Ensayos dermatológicos o clínicos: Son estudios que implican ser supervisados por un equipo médico calificado. Se realizan en un grupo de voluntarios humanos a quienes se le aplica el producto y se mide el objetivo a evaluar. Para productos con finalidad de protector solar, deben incluir el estudio de FPS demostrado con estudios clínicos; y los productos que se declaren y promocionen para ser utilizados en bebes y niños deben respaldarse de un estudio de hipoalergenicidad que garantice la seguridad. (Tapia Vásquez 2013) 1.2 Estudios de seguridad toxicológica en la evaluación de especies vegetales Los estudios de seguridad toxicológica se realizan con el objetivo de evaluar la seguridad de los cosméticos e ingredientes. En especial, un razonamiento basado en el balance entre riesgos y beneficios no debe servir como justificación de un riesgo para la salud humana. Pues existen productos que tienen un especial riesgo como son aquellos que están permitidos, pero con ciertas restricciones: colorantes, conservantes y filtros solares. Existe un Comité Científico de Seguridad de los Consumidores (SCCS) que asesora a comisiones, etc sobre temas relacionados con la seguridad de estos. (Roozbahani, Zahraie et al. 2013); (Zessin 2004) Dichos estudios aportan información sobre la irritación y corrosión a nivel dérmico y ocular, sensibilización y absorción dérmica, mutagenicidad y genotoxicidad entre otros. Los estudios de toxicidad repetida aportan información de la toxicidad de productos tras aplicación repetida y aportan el valor de NOAEL (concentración en la que no se observa efectos adversos) que sirve para determinar el Margen de Seguridad (MoS) o Margen de Exposición (MoE) de los ingredientes. Actualmente, se ha prohibido el uso de animales de experimentación en los ensayos de seguridad de cosméticos. Las autoridades competentes en este campo están haciendo un esfuerzo para validar científicamente métodos alternativos para llevar a cabo la evaluación rigurosa de la seguridad, que no impliquen la utilización de animales y que estén validados u homologados como científicamente válidos por los organismos necesarios, con la consideración debida al desarrollo de la validación en la Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos (OCDE). (Griesinger, Desprez et al. 2016) 14 1.2.1. Estudios toxicológicos agudos Los ensayos de toxicidad aguda describen los efectos adversos para la salud después de una única aplicación del producto según la vía de administración; oral, dérmica o inhalatoria. Los métodos a emplear para este tipo de estudio son: 1. Ensayo de la dosis fija (OECD 420) (Azlan, Abd Ghafar et al. 2020): La guía de la OECD 433 (Inhalación aguda por dosis fija) establece una única dosis de aplicación no letal dependiendo si hay signos de toxicidad o mortalidad. 2. Ensayo clásico de clase toxicidad aguda (OECD 423) (Vasconcelos Gomes de Oliveira, Angela Aranda de Souza et al. 2021): Permite calcular un valor aproximado de dosis letal. 3. Método up & down (OECD 425) (Bhandari, Singh et al. 2021): Permite una estimación del valor de DL. 50. 1.2.2 Estudios alternativos en toxicología La cooperación internacional en el desarrollo de métodos alternativos de ensayo para los cosméticos tiene lugar bajo el Marco para la Cooperación Internacional sobre métodos de ensayo alternativos (ICATM). Asimismo, se han desarrollado un gran número de métodos alternativos que están validados y aceptados y que se utilizan para la evaluación de los ingredientes cosméticos. (Bernauer, Bodin et al. 2018) En gran medida, ciertas corrientes regulatorias medioambientales para estudios de estimación de riesgo, consideran por razones éticas y económicas el uso racional de animales de experimentación. (Toledo, Jiménez et al. 2007); (Kirk 2018); (Hubrecht and Carter 2019) En este sentido surge como alternativa, integrar en una única herramienta, datos in vitro e in silico sobre cinéticas, metabolismo y toxicidad de órganos para predecir la toxicidad aguda oral en humanos y clasificar las sustancias en CLP y GHS Toxicity, (Clark 2018). Además, se establecen bases para el uso de citotoxicidad como método para estimar las dosis iniciales para ensayos de toxicidad oral aguda. (Oecd 2010) En cuanto a ensayos para sustituir a los estudios de irritación ocular se muestran: 15 1. Ensayo de Opacidad corneal en córnea aislada bovina (BCOP) (OECD 437): (OECD. 1994) Se basa en la aplicación de productos sobre córneas bovinas aisladas y medir la opacidad de dicha córnea tras el contacto con el producto en estudio. 2. Ensayo del ojo aislado de pollo (ICE) (OECD 438): (OECD. 1994) Se mide la opacidad inducida en la córnea, así como el engrosamiento de la misma. 3. Método de pérdida de fluoresceína (OECD 460):(OECD. 1994) Método in vitro que sirve para identificar productos solubles en agua que sean corrosivos o irritantes severos. Se utiliza un cultivo en monocapa de células MDCK que separan dos cámaras y se utiliza la fluoresceína como marcador. Aquellos productos irritantes desestabilizan la capa de células y la fluoresceína pasa al otro lado de la cámara. En el caso de los métodos para reemplazar al ensayo de irritación dérmica destacan: 1. Método de Resistencia Eléctrica Transcutánea (TER) para valorar la corrosión de la piel (OECD 430): (OECD. 1994) Utiliza piel de rata y mide el cambio en la resistencia eléctrica transcutánea provocada por un producto corrosivo. 2. Método de Corrosión dérmica in vitro utilizando piel humana reconstruida (OECD 431): (OECD. 1994) Utiliza MTT para valorar la viabilidad celular. 3. Ensayo in vitro de irritación dérmica con epidermis humana reconstruida (OECD 439): (OECD. 1994) Permite utilizar diferentes modelos de epidermis reconstruida (Episkin™, Epiderm™, SkinEthic™, LabCyte EPI-MODEL24 SIT), así como otros similares y que se conocen coloquialmente como métodos “me-too”. Se basan así mismo en la cuantificación de viabilidad o muerte celular mediante el método MTT. Se considera irritante aquel producto que reduce la viabilidad celular en más del 50%. Para estudios de sensibilización dérmica se presentan como métodos sustitutivos: 1. Ensayo conocido como DPRA (Peptide Reactivity assay) in vitro: Se basa en que los productos químicos que provocan sensibilización son capaces de reaccionar con proteínas que contienen residuos de lisina y de cisteína. (Gerberick, Vassallo et al. 2004); (Gerberick, Vassallo et al. 2007) 2. Método KeratinoSens™ o ARE-Nrf2 luciferasa: Se basa en que los productos sensibilizantes son capaces de producir inducción de determinados genes que están regulados por una respuesta antioxidante. (Natsch 2010); (Emter, Ellis et al. 2010) 16 En estudios de absorción dérmica se presenta como alternativa: 1. Absorción in vitro: Este método utiliza piel humana o de cerdo, de la que se separa la epidermis y se coloca en cámaras especiales con dos compartimentos uno donde se aplica el producto y otro que es el receptor de donde se toman muestras para analizar el contenido del producto que ha atravesado la epidermis. Para los estudios de Mutagenicidad/Genotoxicidad están: 1. Ensayo de mutación inversa en bacterias (OECD 471, Test de Ames): (OECD. 1994) La suspensión bacteriana es expuesta a la sustancia a testar en presencia y ausencia de un sistema exógeno de activación metabólica. Luego la solución se somete a una preincubación para después mezclarse con una capa de agar antes de ser esparcida sobre placas con medio mínimo. Tras 48-72h las colonias revertientes son contadas y comparadas con el número de colonias revertientes del control de solvente. 2. Ensayo de mutaciones en células de mamíferos, MCM (OECD 476): (OECD. 1994) Se emplean células mutantes deficientes en las proteínas Hprt o XPRT. Una suspensión celular es expuesta a la sustancia en presencia y ausencia de un sistema exógeno de activación metabólica. Luego son subcultivadas y mantenidas durante 7-9 días para favorecer la expresión fenotípica mutante. Tras este período, la frecuencia de mutación se determina sembrando un número conocido de células en medio con un agente selectivo para detectar colonias mutantes y en medio sin agente de selección para determinar la viabilidad. 3. Ensayo de micronúcleos in vitro, MNT (OECD 487): (OECD. 1994) Células de mamífero son expuestas a la sustancia en presencia y ausencia de un sistema de activación metabólico externo. La exposición es continuada hasta que se produzca la mitosis de las células. Luego, estas serán teñidas y contados los micronúcleos presentes solamente en células binucleadas (han quedado paradas en esta fase tras la aplicación de citocalasina B) o bien en aquellas células donde se muestren signos de haber tenido división celular. 4. Ensayo de aberraciones cromosómicas en células de mamífero, ACT (OECD 473):(OECD. 1994) Una suspensión de células de mamífero es expuesta a la sustancia en presencia y ausencia de un sistema metabólico externo para ser posteriormente 17 arrestadas en metafase. Finalmente, las células en metafase serán analizadas para determinar la presencia de aberraciones cromosómicas. Como alternativa a los estudios de Carcinogenicidad se encuentra el ensayo de transformación celular (CTA, Cell Transformation Assay). El test tiene 2 variantes, según el sistema experimental empleado; o células embrionarias de hámster sirio (SHE) o fibroblastos Balb/C 3T3. Ambas variantes analizan visualmente parámetros específicos relacionados con el fenotipo y patrón de crecimiento celular contando la cantidad de colonias transformantes y número de focos formados. En cuanto a estudios de toxicidad de la reproducción se refieren: 1. Ensayo de células madre embrionarias, EST (DB-ALM Protocol 113): Se basa en determinar la inhibición de diferenciación celular combinada con diferente sensibilidad al daño citotóxico de tejido embrionario y adulto. Emplea 2 líneas establecidas, ES (D3) como tejido embrionario y fibroblastos (3T3) como tejido adulto. La ausencia de la citoquina leukemia inhibiting factor permite que las células ES formen cuerpos embrioides (EBs) y se diferencien a tejido contráctil, siendo más sensibles a agentes tóxicos que las células adultas, estableciendo relación entre las IC50 de ambas líneas y la respuesta a la diferenciación que permite clasificar las moléculas en no-embriotóxica, moderadamente y fuertemente embriotóxica. 2. En el caso del ensayo con embriones enteros, WEC (DB-ALM Protocol 123): Se basa en el cultivo de embriones de rata durante el desarrollo de los órganos. La exposición a la sustancia permite detectar letalidad, retrasos en el desarrollo o anormalidades e inferencias en la diferenciación. 3. Ensayo de micromasas, MM (DB-ALM Protocol 122- The Micromass Test - Method of Brown): Se basa en el cultivo primario de células neuronales y de los miembros de embriones de rata, donde la suspensión de células primarias es cultivada in vitro. La distribución de su crecimiento, migración y segregación seguidos del tratamiento con la sustancia permite evaluar un posible potencial embriotóxico para las fases mediana y tardía del desarrollo en mamífero. 18 4. Modelo experimental: En las últimas décadas, el pez cebra está cobrando importancia, incluso la OECD ha aceptado un ensayo (OECD 236, FET) (OECD. 1994) en la sección de los efectos bióticos. Para estudios de toxicocinética están los cultivos de Caco-2, que permiten describir fenómenos que experimenta una sustancia desde que entra en contacto con el cuerpo hasta que es eliminado del mismo. Incluye la absorción, distribución, biotransformación y excreción. Existen diferentes modelos in vitro que pueden servir para estudiar la absorción de sustancia a través de la piel (modelos de epidermis reconstruida) o desde el tracto gastrointestinal (cultivos de células Caco-2) (Prieto, Hoffmann et al. 2010); (Turco, Catone et al. 2011). También se utilizan modelos tridimensionales de piel para el estudio del metabolismo en la piel (Hewitt, Edwards et al. 2013)o cultivos de hepatocitos para estudiar el metabolismo hepático. (Skare, Hewitt et al. 2009) En cuanto a los ensayos de fototoxicidad destacan el ensayo in vitro de fototoxicidad 3T3 NRU (OECD TG 432): (OECD. 1994)Se basa en el estudio de la citotoxicidad de fibroblastos 3T3 mediante el ensayo de captación de rojo neutro. Se compara dicha citotoxicidad en presencia y ausencia de irradiación con luz UV. En el anexo 1, se resumen los principales métodos alternativos validados para evaluar la seguridad de cosméticos junto a las posibles limitaciones de uso. 1.2.3 Estudios de irritabilidad dérmica La prueba de irritabilidad dérmica está comprendida dentro de las pruebas toxicológicas de corta duración y permite la obtención de datos sobre el poder irritante de un químico o producto natural al ponerlo en contacto con la superficie de la piel. Aunque pueden utilizarse varias especies de mamíferos, la especie más comúnmente utilizada es el conejo albino. Este test se ubica dentro de las pruebas de Primera Barrera, imprescindible para formas farmacéuticas de uso dérmico y productos cuyo uso presupone el contacto con la piel. Aparece estipulado como obligatorio, para este tipo de sustancia, por Agencias Regulatorias internacionales (Pinto, Machado et al. 2015), así como por la Agencia Regulatoria Cubana (CECMED). 1.2.4 Estudios de irritabilidad oftálmica 19 La prueba de irritabilidad oftálmica o Test de Draize está comprendida dentro de las pruebas toxicológicas de corta duración y permite la obtención de datos sobre el poder irritante de un químico (medicamentos, cosméticos, químicos industriales, entre otros) para predecir daños al ojo humano cuando una sustancia entra en contacto con sus estructuras. La especie a utilizar en este tipo de ensayo es el conejo albino. Este test es ampliamente utilizado para evaluar el daño potencial de sustancias químicas sobre el ojo humano y aparece estipulado como estudio obligatorio para este tipo de sustancias por Agencias Regulatorias Internacionales (Verheyen, Braeken et al. 2017), así como por la Agencia Regulatoria Cubana (CECMED). El conejo albino ha sido la especie más utilizada en estudios de irritabilidad ocular debido a que: ✓ Sus ojos son relativamente grandes al compararlos con su talla corporal, además tiene un área corneal relativamente grande respecto al globo ocular por lo que los daños corneales son observados con relativa facilidad. ✓ La falta de pigmentación de los ojos hace que las lesiones del iris sean observadas con mayor facilidad. ✓ El ojo del conejo es un modelo sensible para la detección de irritantes oculares ya que su reflujo lagrimal es menor y más viscoso que el del humano por lo que los materiales instilados en ellos deben ser expulsados con menor facilidad. ✓ Adicionalmente tiene el reflejo del pestañeo menos desarrollado lo que provoca un menor aclaramiento de la sustancia en comparación con el hombre. Estos factores pueden intensificar el contacto con la sustancia y aumentar la respuesta al compararlo con lo que probablemente ocurriría en el ojo humano, constituyendo esto un factor de seguridad. ✓ Los conejos se producen y mantienen con relativa facilidad bajo condiciones de laboratorio. 1.2.5 Estudio de toxicidad dosis repetida por 28 días El modelo experimental de administración por dosis repetidas durante 28 día se emplea según la metodología descrita por la guía para el ensayo de sustancias químicas 407 de la 20 Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico (Jujun, Pootakham et al. 2008). La especie a utilizar en este tipo de ensayo es la rata Wistar. Permiten evaluar los efectos tóxicos que ocurren como resultado de una exposición diaria repetida de una sustancia durante un período concreto de vida del animal. Estos ensayos permiten conocer la toxicidad en órganos diana, curvas de dosis respuesta, respuesta tóxica de metabolitos secundarios formados en el organismo, respuestas tardías, efectos acumulativos y diferencias entre las dosis que no causan efectos adversos de las que causan daño. 1.2.6 Estudios Toxicológicos en el Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus Estudios de seguridad toxicológica en la primera etapa han sido diseñados para evaluar el crudo de saponinas de la especie Agave Brittoniana Trel. spp. Brachypus objeto de esta investigacion. En los estudios agudos a dosis límite de 300mg/kg no se apreciaron signos de toxicidad. Por otra parte, se evaluaron los test de genotoxicidad en eritrocitos de médula ósea y en reticulocitos de sangre periférica y en ninguno de los casos se clasifican como genotóxicos los extractos ricos en saponinas de esta especie, en dosis ensayadas superiores a las farmacológicas.(Navarro Pérez 2016) También, se han realizado otras investigaciones, tanto in vitro como in vivo para demostrar la actividad que realiza dicha planta; además de numerosos estudios experimentales que han sido conducidos para corroborar la efectividad farmacológica de la especie en los crudos de saponinas y/o sapogeninas contentivas en extractos hidroalcohólicos y de sus fracciones. No obstante, resulta necesario realizar una serie de estudios toxicológicos a la planta para así cumplir con los requisitos de seguridad necesarios, los cuales son de suma importancia a la hora de la produccion de un cosmecéutico. 1.3 Entidades regulatorias cubanas. Regulaciones vigentes Hoy en día, en el mundo existen diferentes instituciones que entre sus funciones realizan la actividad regulatoria. En tal sentido, en España, está vigente el Sistema Español de Cosmetovigilancia, que recoge y evalúa información sobre efectos graves no deseados ocasionados por cosméticos. Además, en Estados Unidos se encuentra como organismo regulador la Food and Drug Administration referente a nivel mundial. También, tenemos a la European Commission (EC) en Europa, país donde los productos cosméticos, como 21 formulación química, deben ser registrados en los listados REACH, que es el Reglamento (CE), relativo al registro, evaluación, autorización y restricción de sustancias químicas (Hernandez Pulido, Lopez Sanchez et al. 2020). En Colombia, se encuentra el Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos (INVIMA), una entidad de vigilancia y control de carácter técnico científico, que trabaja para la protección de la salud individual y colectiva, mediante la aplicación de normas sanitarias asociadas al consumo y uso de alimentos, cosméticos y otros productos. Este país, cuenta además con el Organismo Nacional de Acreditación de Colombia (ONAC), una corporación de carácter privado, de naturaleza y participación mixta, el cual tiene entre sus objetivos ejercer autoridad de monitoreo en buenas prácticas de laboratorio de la OECD. En Argentina radica la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT) que regula a los cosméticos través de la Resolución MS y AS N°155 del año 1998 y actualiza normas relacionadas con productos cosméticos, así como actividades inherentes a ellos. Dicha reglamentación Técnico sanitaria está a su vez armonizada con las normativas de la Unión Europea y del grupo MERCOSUR del cual Argentina es miembro. Según la disposición N° 345/06 (ANMAT) armonizada con la Resolución del Mercosur N° 07/05, se categorizan los productos cosméticos de grado 1 y grado 2 de acuerdo al nivel de exigencias para la comprobación de seguridad, eficacia, modo y restricciones de uso. En Cuba, a su vez, existen varias instituciones, que pertenecen al Ministerio de Salud Pública (MINSAP) que tienen entre sus funciones la actividad regulatoria: el Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología (INHEM) es la única entidad regulatoria en el país responsable de la recepción, evaluación, aprobación o rechazo de solicitudes de producción e importación de cosméticos y productos de aseo personal. Por su parte, el Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED), incluye dentro de los equipos y dispositivos a regular, algunos de los relacionados con tratamientos estéticos.(Sánchez 2017) Otro centro regulador en Cuba es el Departamento de Registro y Control Sanitario radicado en el Instituto de Nutrición e Higiene de Alimentos (INHA), como parte del sistema de control y vigilancia establecido por el MINSAP, realiza de conjunto con la Inspección Sanitaria 22 Estatal (ISE) el control higiénico sanitario o control higiénico nutricional, según corresponda. En esta entidad se emite el Certificado Sanitario a varios productos, entre ellos a los cosméticos, posterior a la evaluación de riesgos que conlleva su empleo o consumo para la salud del hombre y previo a su comercialización en el país. Además, se encuentra también la Aduana General de la República (AGR), la cual coopera en las tareas de inspección y control que desarrollan los Inspectores Sanitarios y/o funcionarios del CECMED y del Departamento de Registro y Control de Calidad Sanitaria. Generalmente, las entidades regulatorias tanto en Cuba como en el mundo manifiestan una importancia relevante, ya que todas de una forma u otra tienen como prioridad ejercer la regulación. Desarrollan eventos que revolucionan las prácticas para la reglamentación y control por las autoridades nacionales, que recomiendan la elevación de los estándares y marcan pautas y nuevos puntos de referencia. Contribuyen al fortalecimiento de la capacidad reguladora para medicamentos, vacunas y equipos médicos. Son el motor impulsor de las mejores prácticas y perfeccionamiento de las metodologías e indicadores para la medición del desempeño, ligados o no a los procesos de precalificación de medicamentos. Han contribuido también al desarrollo alcanzado por el Sistema Nacional de Salud cubano y la introducción por el mismo de tecnologías avanzadas. Además, la incorporación de la Ciencia Reguladora a las estrategias y políticas de autoridades de vanguardia para atemperar su misión de protección y promoción de la salud con los nuevos avances científicos, contribuyen a acelerar la conversión de las innovaciones en medicamentos y equipos médicos más seguros y efectivos. Por tal motivo, resulta significativo, dado que el Sector Salud constituye una importante rama que oferta servicios, la implementación de Sistemas de Gestión de la Calidad en esta esfera ya que con esto se garantiza que se brinden servicios científico técnicos confiables, seguros y eficaces. En tal medida, debido a que los cosméticos van a estar en contacto con el organismo, ya sea por breve o mayor tiempo, es muy importante mantener un control estricto de los análisis físico químicos, microbiológicos y toxicológicos, tanto de las materias primas como de los productos terminados, pues alguna desviación en los mismos puede repercutir en la calidad sanitaria de los productos y en su posible afectación a la salud. (Puerto Rodríguez and Prieto Díaz 2004) 23 En la actualidad existe una regulación internacional específica para las BPF de cosméticos: La Organización Internacional de Normalización (ISO, por sus siglas en inglés) ha publicado en 2010 la Norma ISO 22716 como una Guía de Buenas Prácticas de Fabricación para Productos Cosméticos que fue preparada por el Comité Técnico ISO/TC 217. En la Unión Europea esta norma sería considerada de obligatorio cumplimiento a partir de junio del 2013. Esta guía, recoge las directrices de normativas y requisitos que han ido surgiendo en los últimos años para dar respuesta a las necesidades de regulación del sector de Fabricación de Cosméticos, en orden a mejorar la calidad y apoyar así tanto a los fabricantes mayoristas, minoristas y proveedores. (Lorenzo López 2014) Según plantea la Garantía Europea de Calidad (EQA, por sus siglas en inglés) esta norma tiene como objetivos: 1. Establecer un adecuado control de la fabricación 2. Asegurar la calidad en las fases del proceso de producción, almacenamiento, conservación, y expedición de los productos cosméticos 3. Asegurar la máxima calidad de los productos 4. Obtener la máxima seguridad para los consumidores Además, constituye las directrices destinadas a proporcionar una guía de BPF para la industria cosmética teniendo en cuenta las necesidades específicas de este sector. Proporcionan consejos prácticos y de organización que conciernen a la gestión de los factores humanos, técnicos y administrativos que afectan a la calidad del producto. Se han redactado a fin de permitir su utilización siguiendo el flujo de los productos desde la recepción a la expedición y constituyen una herramienta de dinamización de la mejora continua de los procesos. Las BPF, especialmente deben estar centradas en: 1. Los recursos humanos e infraestructura 2. Materias primas y material de acondicionamiento 3. Control de los procesos y el laboratorio de control de calidad 4. Subcontratación 24 La introducción de la norma ISO 22716 supone un importante paso la seguridad de los productos cosméticos a nivel mundial, ya que este estándar ISO 22716 en su redacción final consiste en una norma auditable y certificable que especifica: 1. Los requisitos para los productos cosméticos. 2. Sistemas de gestión de seguridad con incorporación de elementos de BPF. 3. Evaluación del riesgo en combinación con la calidad global. Como ventajas de la ISO 22716:2007 se plantea: 1. Integra los requisitos típicos sobre la calidad del proceso y el producto, requisitos de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) con otra normativa sobre calidad. 2. Permite una fácil implantación en todas las organizaciones de todos los tamaños y niveles de complejidad. 3. Conforma una base para el cumplimiento de la calidad y seguridad en la cadena de distribución de los productos cosméticos aceptada internacionalmente. 4. Fomenta el cumplimiento de la normativa adoptada por los reguladores en todo el mundo. 5. Controla y reduce la peligrosidad de los productos cosméticos y promueve la mejora continua a lo largo de toda la cadena de distribución. (Lorenzo López 2014) La Norma ISO 22716 se puede integrar con otros sistemas de gestión, como es el caso del Sistema de Gestión de la Calidad ISO 9000 o del Sistema de Gestión Medioambiental ISO 14000. Pero sus directrices no son aplicables a las actividades de investigación y desarrollo y de forma global, no incluye aspectos referentes a la prevención de riesgos laborales en las zonas de trabajo, ni los aspectos referentes a la protección del medio ambiente. Estos aspectos son responsabilidad de la empresa y son regulados por la legislación vigente. (Lorenzo López 2014) La realización de evaluaciones sobre la aplicación de las BPF de cosméticos cuenta con guías para la realización de las auditorías basadas en la norma ISO 22716 que facilitan la evaluación de su implementación y aplicación en la entidad productora de cosméticos (Lorenzo López 2014); (Melchor Bendezú and Alvarado Menéndez 2008). En ellas se incluye la consideración de aspectos como: personal, residuos, locales, equipos, producción, productos acabados, laboratorio de control de calidad, documentación, 25 auditoría interna, control de cambios, desviaciones, subcontratación, tratamiento de productos fuera de especificaciones, materias primas y material de acondicionamiento, así como reclamaciones y retiradas del mercado. Además, la regulación sanitaria de las preparaciones farmacéuticas elaboradas con base en productos naturales es un tema polémico por sus implicaciones estrictamente sanitarias, políticas y económicas. Debido a la preocupación del MINSAP por ejercer control y vigilancia sanitaria de todos los productos que pueden tener influencia sobre la salud humana, este creó la base legislativa que permitió la creación de dicho registro y las actividades inherentes a la Inspección Sanitaria Estatal (ISE) (de Estado); (Sánchez 2018); (Ramos Domínguez 2005); (González, Pérez et al. 2015); (Suárez Pita 2010); (Cepeda Vargas 2011); (Briceño Bautista and Urrego Beltrán 2016). El Registro Sanitario se complementa con el control y vigilancia que debe llevar a cabo la ISE para garantizar que los productos y tecnologías antes mencionados, que se comercialicen en Cuba, se caractericen por su calidad, seguridad e inocuidad. Es de vital importancia la acreditación por la Norma Cubana NC ISO/IEC 17025: 2006 (COMPARACIONES, DE ENSAYOS et al.) de las técnicas físico- químicas, microbiológicas y toxicológicas que son necesarias para verificar que se cumplen los requisitos de seguridad de productos que se evalúan para el otorgamiento del Certificado Sanitario, dado que el cumplimiento de esta norma demuestra la competencia del laboratorio para producir datos y resultados técnicamente válidos. Un producto cosmético debe estar etiquetado de acuerdo con los reglamentos de etiquetado de cosméticos que aparecen en el Manual de etiquetado de cosméticos. Además, de acuerdo con la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, los productos e ingredientes cosméticos, excepto los colorantes, no necesitan la aprobación de la Administración de Medicamentos y Alimentos (FDA) antes de comercializarse en el mercado; y no exige a las empresas de cosméticos registrar sus establecimientos ni indicar las formulaciones de sus productos en la FDA. Este tipo de producto, se podrá usar cuando cumpla con la norma NTE INEN 2867, establecida en la NTE (Norma Técnica Ecuatoriana), el producto orgánico debe ser evaluado por medio de pruebas microbiológicas con la comprobación de su efectividad probando cualitativa y cuantitativamente; y fisicoquímicas, incluyendo pH y viscosidad; estos productos cosméticos se clasifican según sus funciones 26 y propiedades en dos grados, los productos para piel acneica, se encuentran dentro del grado 2, que contienen específicas indicaciones de acuerdo a la comprobación de eficacia y seguridad, otorgándole una valoración en Nivel Alto según la Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria. (Moreno Altamirano and Ronquillo Merchán 2018) El capítulo desarrollado cumple con los propósitos que se pretendían abordar, pues se presentan de forma clara y detallada los aspectos y características básicas necesarias que se deben conocer tanto de los cosmecéuticos como de la planta de origen vegetal Agave, además de los estudios realizados y por realizar. También se mencionaron y caracterizaron las entidades regulatorias en el mundo y en Cuba, destacando las regulaciones vigentes. MATERIALES Y MÉTODOS 27 CAPITULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Tipo y método de investigación La investigación se considera de tipo no experimental. El método empleado fue un estudio descriptivo, con un enfoque predominantemente cualitativo en función de los objetivos específicos de la investigación. 2.2 Contexto de la investigación La Unidad de Toxicología Experimental (UTEX) perteneciente a la Universidad de Ciencias Medicas de Villa Clara tiene como misión realizar evaluaciones fármaco-toxicológicas, utilizando tantos modelos in vivo como in vitro a las nuevas sustancias sintéticas o naturales con potencialidades terapéuticas y que se pretendan introducir en el sistema nacional de salud, lo que da salida a los proyectos de investigación y servicios científico-técnicos, que nos identifica como una Entidad de Ciencia e Innovación Tecnológica. Siguiendo esta línea, en la investigación se propone confeccionar una metodología que permita prever todos los posibles estudios de seguridad toxicológica necesarios para el registro de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus con fines cosmecéuticos cumpliendo con las exigencias regulatorias del país. 2.3 Diseño general de la investigación El objetivo del presente trabajo consistió en diseñar una metodología para el desarrollo de los estudios de seguridad toxicológica de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus para su registro con fines cosmecéuticos. Metodológicamente se adoptó el siguiente esquema para la realización de las tareas que dieron cumplimiento a los objetivos propuestos: 2.3.1 Se realizó la consulta y análisis de documentos normativos y regulatorios vigentes, relacionados con los Cosméticos en Cuba. La revisión incluyó sitios web de órganos reguladores nacionales: Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED) y el Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología (INHEM). 28 2.3.2 Se realizó el análisis de los procedimientos normativos (OECD/OCDE Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico) que rigen los estudios toxicológicos para comprobar la seguridad de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus. Para este análisis se tuvo en cuenta los procedimientos normativos (OECD/OCDE) según métodos descritos en las Guías de la OECD (según sus siglas en inglés) referidas a la toxicidad dérmica aguda (OECD 402), irritabilidad dérmica (OECD 404) e irritabilidad oftálmica (OECD 405), Método de la dosis fija (OECD 420), Método de la clase tóxica aguda (OECD 423), Procedimiento “Arriba y abajo” (OECD 425) y dosis repetida 28 días (OECD 407). En la planificacion de estas etapas se tuvo en cuenta el cumplimiento de los principios eticos y de bioseguridad en la experimentación animal, que implica la correcta manipulación de las muestras y desechos biológicos, el uso de los implementos de seguridad para el investigador, así como la ejecución de las pruebas en lugares idóneos, que garantizan no solo la calidad de la investigación, sino también la protección del personal y del medio ambiente. 2.3.3 Propuesta de una metodología para el desarrollo de estudios de seguridad toxicológica Para la confección de la metodología se analizó las diferentes etapas por el cual debe trascurrir los estudios de seguridad toxicológicas. Estas etapas coinciden con los requisitos regulatorios tanto para los estudios toxicológicos como el registro de productos cosméticos y fitomedicamentos. Esta metodología se mostró utilizando un diagrama de flujo para su mejor comprensión . RESULTADOS Y DISCUSIÓN 30 CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1 Análisis del diseño general de la investigación 3.1.1 Consulta y análisis de documentos regulatorios para el registro de cosméticos En Cuba existen diferentes instituciones que pertenecen al Ministerio de Salud Pública (Minsap) que tienen entre sus funciones la actividad regulatoria. En este sentido, el Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED), autoridad reguladora en Cuba, creado en 1989, ha desarrollado regulaciones relativas a producción, control de calidad, almacenamiento y distribución de medicamentos, un conjunto de “Buenas Prácticas”, que se ha perfeccionado a la vez con la industria nacional y los estándares internacionales de referencia. En la regulación No. 16-2012 se han actualizado aspectos aplicables a la fabricación de estos productos y, mantenido elementos de documentos vigentes sobre Buenas Prácticas de la Unión Europea, Canadá, Estados Unidos y países de Latinoamérica. Se ha enriquecido con la experiencia acumulada en inspecciones farmacéuticas estatales efectuadas a la industria nacional y criterios de fabricantes; elementos que han sido adaptados, considerando el estado actual de la ciencia y tecnología en Cuba. Su objetivo es establecer requisitos para el cumplimiento de condiciones exigidas para fabricar y comercializar medicamentos de origen natural, que serán de estricto cumplimiento en laboratorios destinados a este fin (Irela, Patricia et al. 2021). Por su parte, El Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología (INHEM) es el responsable de la recepción, evaluación, aprobación o rechazo de las solicitudes de producción e importación de los cosméticos y productos de aseo personal, los cuales se encuentran clasificados por grupos de productos: infantiles, depilatorios, de perfumería, para el embellecimiento de los ojos, para el cuidado y embellecimiento del cuerpo y el cabello, para uso bucal y embellecimiento de los labios, para las uñas, así como cosméticos naturales y de origen apícola. Para ello, utilizan el Registro sanitario de alimentos, cosméticos, juguetes y otros productos de interés sanitario, el cual contiene la compilación de las regulaciones e indicadores requeridos en lo referente a requisitos, metodología de evaluación y dictámenes de los productos objeto de registro sanitario para autorizar su 31 comercialización y libre venta en el país (Martínez and Pita 2016). Se basan en el cumplimiento de las normas cubanas relacionadas con los cosméticos, las cuales se elaboran y perfeccionan en el Comité Técnico de Normalización (CTN) de cosméticos N° 52 (en el Trabajo 2020). Sin embargo, en ninguna de las dos instituciones reguladoras nacionales (CECMED e INHEM) se registran productos cosmecéuticos, nutricosméticos, nutracéuticos inyectables de uso cosméticos, tintas para tatuajes, entre otros y la mayoría de los equipos de uso estético; porque carecen de regulación en Cuba (Irela, Patricia et al. 2021) y en muchos otros países (Alegre 2020). Los cosmecéuticos, objetivo de esta investigación, ya representan el 80 % del mercado de los cosméticos, los mismos, como ya conocemos, están dirigidos a ejercer funciones reparadoras sobre la piel, por ejemplo, para luchar contra el fotoenvejecimiento, prevenir y contra-atacar las arrugas o las manchas, así como tratar la piel grasa o seca, el acné, la dermatitis, por lo que potencia una piel sana y a su vez despierta gran interés en la población, fundamentalmente, femenina (Fernández Ibarz 2020). Son ofertas muy tentadoras, pero muy pocos cosmecéuticos están avalados por evidencias preclínicas. Es de destacar, que en nuestro país el INHEM es la única entidad facultada para efectuar las actividades del registro sanitario de los cosméticos y productos que requieren de registro sanitario como bien se expresó anteriormente. En el año 2017, dicha entidad presentó la sexta versión del “Registro sanitario de alimentos, cosméticos, juguetes y otros productos de interés sanitario” actualizado hasta esa fecha, en concordancia con las Normas Internacionales vigentes, organizado en XXII capítulos y 16 Anexos. El capítulo XII se refiere a los Cosméticos y en él incluye los Indicadores toxicológicos para el estudio de los cosméticos por categoría (Tabla 1). 32 Tabla 1. Indicadores toxicológicos para el estudio de los cosméticos Fuente: INHEM. Registro sanitario de alimentos, cosméticos, juguetes y otros productos de interés sanitario: regulaciones e indicadores. 6ta. Versión, La Habana 2017. La Habana: INHEM; 2017 Disponible en: https://instituciones.sld.cu/inhem/files/2017/12/Manual-Registro-Sanitario-2017.pdf). Se evidencia en esta versión del registro sanitario que se ha tenido en cuenta mayor número de estudios de seguridad toxicológica, para cosméticos, con relación a versiones anteriores que sólo incluia Irritabilidad dérmica, Irritabilidad oftálmica y fototoxicidad. 3.1.2 Análisis de los procedimientos normativos que rigen los estudios toxicológicos para comprobar la seguridad de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus Productos Irritabilidad dérmica Irritabilidad oftálmica Fototoxicidad Mucosa rectal Mucosa bucal Mucosa Vaginal Toxicidad Aguda Oral Lociones y perfumes x x x Champús y similares x x Emolientes (cremas y tintes) x x Detersivos Detergentes Jabones x x Productos para el uso bucal x x Almohadillas sanitarias Toallitas húmedas Papel sanitario x x x x Sombras x x Coloretes, polvos, compactos y maquillajes x x https://instituciones.sld.cu/inhem/files/2017/12/Manual-Registro-Sanitario-2017.pdf 33 La realización de un conjunto de estudios toxicológicos en diferentes especies de animales permite identificar la toxicidad intrínseca, así como los órganos y tejidos diana de la toxicidad relacionada con el compuesto en evaluación. El tipo y diseño de estos estudios estará en dependencia de las características y destino final del producto, pero en la generalidad de los casos, el objetivo debe ser la demostración de las potencialidades tóxicas por administración única (toxicología aguda), administraciones repetidas (subcrónica y crónica) y estudios especiales de genotoxicidad, toxicología de la reproducción y la fertilidad, llegando incluso en muchos casos a ser necesario la evaluación de su potencial carcinogénico (Baber, 1994, Garthoff, 1995, CECMED., 2001). Las normativas de la OECD (por sus siglas en inglés) proporcionan información sobre los peligros para la salud que podrían ocurrir tras la exposición según la vía de administración. Aparecen estipuladas como obligatorias, según las características de las sustancias de prueba, por Agencias Regulatorias internacionales, así como por la Agencia Regulatoria Cubana (CECMED). Actualmente la OECD continúa actualizando sus Líneas Directrices para conseguir mejores resultados, esto se evidencia en la evolución que ha tenido, por ejemplo, desde la Línea Directriz 401 (adoptada el 24 de febrero de 1987) que fue actualizada con la 420 (adoptada el 17 de julio de 1992) y esta, a su vez, fue revisada en octubre del 2000. En esta evolución ha existido un cambio de filosofía, paralelo al sentir general sobre experimentación animal in vivo (Persoone y cols., 2000). 3.1.3 Propuesta de una metodología para el desarrollo de estudios de seguridad toxicológica En el diseño de la metodología para evaluar la seguridad toxicológica se tuvo en cuenta la tercera etapa de “La guía metodológica de investigación para el desarrollo de un fitomedicamento” (Hernández, 2017) y fue adecuada según las características del producto natural, estudios farmacológicos realizados y el contexto donde se realizará el estudio de seguridad toxicológica. Las etapas previas son: 34 ✓ Etapa 1. Proceso de planificación y organización ✓ Etapa 2. Proceso de investigación botánica y agronómica ✓ Etapa 3. Estudios farmacológicos, toxicológicos, químicos-farmacéuticos (incluye la formulación). Esta etapa es la más compleja por su alcance y carácter interdisciplinario, pues es donde se realizan los fundamentales procesos de investigación preclínica para obtener bases farmacológicas, toxicológicas y químico-farmacéuticas del candidato, basado en el criterio de alcanzar al final un producto con eficacia, seguridad, calidad y conveniencia deseadas. En nuestra investigación solo se tuvieron en cuenta los aspectos toxicológicos para elaborar la metodología. Propuesta de Metodología Figura 1. Metodología para evaluar la seguridad toxicológica de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus con fines cosmecéuticos. Fuente: Elaboración propia Metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus con fines cosmecéuticos Estudios Toxicológicos Agudos Ensayo de Citotoxicidad Ensayo de toxicidad por dosis repetida por 28 días (407 OECD) Vía Oral Método de la dosis fija (420 OECD) Método de la clase tóxica aguda (423 OECD) Procedimiento “Arriba y abajo” (425 OECD) Vía Inhalatoria Método de toxicidad aguda por inhalación (403 OECD) Vía Cutánea Ensayo de toxicidad dérmica aguda (402 OECD) Ensayo de irritabilidad dérmica (404 OECD) Ensayo de irritabilidad oftálmica (405 OECD) 1 2 3 35 Los estudios de toxicidad aguda están divididos en tres grupos (establecidos según la vía de administración) y son los que conforman mayoritariamente la metodología propuesta (Figura 1). En la valoración y evaluación de las características tóxicas de una sustancia química se suele empezar por un estudio de toxicidad aguda oral. El objetivo del test de toxicidad aguda es la determinación del potencial tóxico de una sustancia química después de la administración o exposición de una dosis única del producto o más de una (suelen ser dosis altas), administradas durante 24 horas. La observación de los efectos se realiza durante un período de 14 días (Botham, 2012). Estos estudios son de gran importancia ya que nos brindan información intrínseca del producto y el posible riesgo que conlleva su exposición aguda, además de que aporta valiosa información para la selección de los niveles de dosis a emplear en los estudios subcrónicos (Arencibia, 2015). Además, según establece las normas reguladoras del Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED) sobre estudios de toxicidad aguda, se incluyeron estudios en los que se evalúa el efecto producido por la administración de una o varias dosis, en un período de hasta 24 horas y observado hasta 14 días. También se tuvieron en cuenta estudios de citotoxicidad como parte de los estudios toxicológicos preclínicos. Estos permiten obtener una información primaria acerca de la toxicidad in vitro del producto natural que se evalúa; son útiles para detectar alteraciones acerca de funciones celulares básicas debido a la exposición a un compuesto prueba que conlleve un daño celular y contribuyen a que se cumpla el principio de las 3Rs (Reducción, Refinamiento y Reemplazo) dentro de la evaluación no clínica. Para estos ensayos se pueden emplear como modelos experimentales, microorganismos, células y órganos aislados, cultivos primarios y líneas celulares. La misma institución, centro insigne en la actividad regulatoria, sugiere incluir para el diseño de los estudios de dosis repetidas, contar con la información acerca de la absorción, distribución, metabolismo y excreción del producto natural, ya que esta es importante para conducir el diseño de estudios toxicológicos y llevar a cabo en general una adecuada interpretación de resultados provenientes de los estudios farmacológicos y toxicológicos. De ahí que los estudios toxicológicos se realizarán con los candidatos promisorios 36 contentivos de metabolitos secundarios, o el ingrediente farmacéutico activo presente en el cosmecéutico, lo que permitirá garantizar la trazabilidad en evaluaciones preclínicas. CONCLUSIONES 37 CONCLUSIONES 1. Los procedimientos normativos y registros analizados carecen de regulaciones para productos cosmecéuticos en Cuba. 2. Las normas de la OECD son procedimientos que guían el trabajo para la realización de los estudios toxicológicos para comprobar la seguridad de un producto. 3. La metodología presentada ha permitido el desarrollo de las investigaciones de seguridad toxicológica, de metabolitos secundarios extraídos de Agave brittoniana Trel. spp. Brachypus con fines cosmecéuticos. RECOMENDACIONES 38 RECOMENDACIONES • Se recomienda que el Minsap como organismo central, al cual responden las instituciones reguladoras nacionales (CECMED e INHEM), sigan trabajando de conjunto en aras de lograr un documento regulador en Cuba para productos Cosmecéuticos. • Aplicar la metodología propuesta al resto de las especies en estudio en la UTEX. • Realizar metodología para completar los estudios de toxicología en el producto final, estos son: toxicología crónica, estudios de toxicidad especial y de toxicidad sobre órganos y tejidos dianas identificados. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Adriaens, E., et al. (2018). "CON4EI: Development of testing strategies for hazard identification and labelling for serious eye damage and eye irritation of chemicals." Toxicology in vitro 49: 99-115. Águila Sánchez, E. (2019). Evaluación del efecto hipolipémico in vivo de sapogeninas y fracción acuosa de las hojas de la especie Agave brittoniana subps brachypus, Universidad Central``Marta Abreu``de Las Villas. Facultad de Química y …. Alegre, M. d. A. S. (2020). "Cooperação Regulatória em Saúde: uma visão latino- americana." Alvaré Morfa, L. (2017). Evaluación toxicológica parcial de Agave britoniana T. subsp. Brachypus, Universidad Central “Marta Abreu “de Las Villas. Facultad de Ciencias …. Anajwala, C. C., et al. (2010). "In vitro cytotoxicity study of agave Americana, strychnos Nuxvomica and Areca catechu extracts using MCF-7 cell line." Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research 1(2): 245. Anunciato, T. 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