TESIS EN OPCION AL TITULO ACADEMICO DE MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL “Embriogénesis somática en plátano cv FHIA- 21 (Musa AAAB) empleando medios de cultivo líquido.” Autor: Ing .Zoe Magalys Sarría Hernández Tutor: Dr. Rafael Gómez Kosky Consultante: MSc. Leyanis García Aguila Santa Clara 2008 IINNSSTTIITTUUTTOO DDEE BBIIOOTTEECCNNOOLLOOGGIIAA DDEE LLAASS PPLLAANNTTAASS TESIS EN OPCION AL TITULO ACADEMICO DE MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGIA VEGETAL “Embriogénesis somática en plátano cv FHIA- 21 (Musa AAAB) empleando medios de cultivo líquido.” Autor: Ing .Zoe Magalys Sarría Hernández Tutor: Dr. Rafael Gómez Kosky Consultante: MSc. Leyanis García Aguila Santa Clara 2008 IINNSSTTIITTUUTTOO DDEE BBIIOOTTEECCNNOOLLOOGGIIAA DDEE LLAASS PPLLAANNTTAASS “La base de un desarrollo impetuoso en los años futuros debe fundamentarse en una ciencia cada vez más desarrollada”. Ernesto “Che”Guevara. A mis padres A mi hija A mi esposo Al culminar el presente trabajo quisiera agradecer - A mi tutor el Dr. Rafael Gómez Koski, por las sugerencias y el apoyo brindado. - A la MSc. Leyanis García Águila, por su ayuda en la realización de este trabajo. - A la Dra.Novisel Veítia por su colaboración en el procesamiento estadístico. - A los compañeros del Laboratorio de Embriogénesis y Transformación Genética por su ayuda. - A todos los compañeros del área productiva por su constante apoyo. - A todos los trabajadores del IBP que de una forma u otra propiciaron la culminación de este trabajo. A todos muchas gracias. Resumen RESUMEN El objetivo de este trabajo fue desarrollar la embriogénesis somática en el cv. FHIA- 21(Musa AAAB), en medios de cultivo líquido, para lo que se estudió el efecto de la densidad de inóculo en la formación, maduración y germinación de los embriones somáticos. En la formación de los embriones somáticos se estudiaron 4 densidades de inóculo (1,0; 2,0; 3,0 y 4,0%), se evaluó el número de embriones formados y el tamaño alcanzados por estos a los 45 días de cultivo en cada densidad. Para la maduración de los embriones somáticos se estudiaron las densidades de inóculo de: 200; 400; 600 y 800m gMF de embriones, evaluándose a los 30 días de cultivo el porcentaje de embriones germinados y al tamaño alcanzado en cada densidad. En la germinación de los embriones somáticos con la utilización de las densidades de inóculo de: 15,0; 20.0; 25,0 y 30,0 gMF de embriones, se evaluó a los 20 días el número de embriones germinados. Se obtuvo como resultado la formación de embriones somáticos en todas las densidades celulares pero la mayor cantidad de embriones somáticos se presentó en la densidad celular de 3,0% VCS, alcanzándose 523,91 embriones, el tamaño de los mismo oscilo entre 20-80 µm a los 45 de cultivo. En la maduración de los embriones somáticos resultó ser la mejor densidad de inóculo 600 mgMF de embriones somáticos lográndose un porcentaje de germinación de 47,72% a los 30 de cultivo, en la densidad de 800 mgMF se observó oxidación fenólica. Para la germinación de los embriones somáticos maduros se obtuvo el mayor número de embriones germinados cuando se utilizó la densidad de inóculo de 30 gMF de embriones somáticos, en SIT a los 20 días de cultivo. Índice ÍNDICE Pág 1 INTRODUCCIÓN 1 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 2.1 Origen 5 2.2 Sistemática y botánica 5 2.3 Cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB) 6 2.4 Embriogénesis Somática 8 2.4.1 Generalidades 8 2.4.2 Características generales de la embriogénesis somática 10 2.4.3 Factores que influyen en la embriogénesis somática 10 2.4.3.1 El genotipo 11 2.4.3.2 El tipo y estado fisiológico del explante 11 2.4.3.3 Los reguladores del crecimiento 12 2.4.3.4 Las condiciones de cultivo 13 2.4.4 Fases de la embriogénesis somática 13 2.4.4.1 Inducción de la embriogénesis somática 14 2.4.4.2 Establecimiento y mantenimiento de células en suspensión 14 Índice 2.4.4.3 Formación de embriones somáticos 17 2.4.4.4 Maduración de los embriones somáticos 18 2.4.4.5 Germinación y conversión en plantas 19 2.5 Influencia de la densidad de inóculo en el desarrollo de la embriogénesis somática en Musa spp 20 3 MATERIALES Y METODOS 23 3.1. Efecto de la densidad celular en la formación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido 26 3.2. Efecto de la densidad de inoculo en la maduración de embriones somáticos en medio de cultivo líquido 28 3.3 Efecto de la densidad en la germinación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido 29 3.3.1 Germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en agitación 30 3.3.2 Germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en Sistemas de Inmersión Temporal (SIT) 30 4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32 4.1. Efecto de la densidad celular en la formación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido 32 4.2. Efecto de la densidad celular en la maduración de embriones somáticos en medio de cultivo líquido 37 4.3 Efecto de la densidad celular en la germinación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido 46 Índice 4.3.1 Germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en agitación 46 4.3.2 Germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en Sistemas de Inmersión Temporal (SIT) 46 5 CONCLUSIONES 50 6 RECOMENDACIONES 51 7 BIBLIOGRAFIA Introducción 1 Los bananos y los plátanos son un componente importante en la alimentación de millones de personas en el mundo tropical, que encuentran en ellos una fuente excelente de carbohidratos, minerales y vitaminas, así como una fuente de divisas para aquellos países que exportan estas frutas frescas (FHIA, 2007). Se estima que la producción de musáceas (banano y plátano) en todo el mundo es de unas 108 millones de toneladas métricas por año según (FHIA, 2007), de las cuales el 68% corresponde a banano y el 32% a plátano. Algunos países de América Latina son los responsables de aproximadamente el 80% de las exportaciones de estas frutas, principalmente Ecuador, Costa Rica, Colombia y Honduras. Por estudios realizados por La Fundación Hondureña de Investigación Agrícola (FHIA), se obtuvieron una serie de diploides mejorados de características superiores que han permitido la generación de híbridos de banano y plátano resistentes genéticamente a la Sigatoka negra y al Mal de Panamá ( FHIA ,2007). En Cuba es elevado el consumo de banano y plátano por sus habitantes debido a que es parte esencial en su dieta alimenticia. La entrada de la enfermedad Sigatoka negra en el año 1990 afectó severamente la producción de banano y plátano locales. Por esta razón, desde esa fecha han estado introduciendo y multiplicando los híbridos de banano y plátano de la FHIA que han tenido gran aceptación entre los productores y los consumidores, tanto para consumo cocido, en tajaditas fritas y algunos de ellos, como frutas frescas. En 1998 se informo que en Cuba se tenían cultivadas unas 8,000 hectáreas con los híbridos de la FHIA, actualmente se tienen Introducción 2 reportes que el área cultivada es de 15,000 hectáreas, entre las que destacan los bananos y en menor proporción el plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB). Lo anterior planteado ha permitido al estado cubano continuar la producción de banano y plátano, sin necesidad de utilizar productos químicos para el control de la Sigatoka negra (FHIA 2007). La propagación in vitro a partir de ápices meristemáticos se ha generalizado a escala comercial y se mantiene como el método más utilizado en esta especie (Ahloowalia et al., 2004). Esta técnica de regeneración de plantas tiene como limitantes la necesidad de realizar un elevado número de operaciones manuales y bajos coeficientes de multiplicación, lo cual aumenta considerablemente los costos de producción (Escalona et al., 2003; Savangikar, 2004). La propagación in vitro de el cultivar híbrido FHIA-21 (Musa spp. AAAB) se realiza actualmente en las Biofábricas cubanas a través del cultivo de brotes axilares, pero presenta en la fase de multiplicación la aparición de plantas con crecimiento en forma de roseta lo que constituye un aspecto negativo para el coeficiente de multiplicación (García et al., 2002). En la medida que aumentó el conocimiento de las técnicas biotecnológicas se amplió la posibilidad de obtener mayores volúmenes de plantas en menor período de tiempo utilizando la embriogénesis somática. En Musa spp. la embriogénesis somática se ha Introducción 3 desarrollado con dos propósitos, el mejoramiento genético y para la propagación masiva de plantas (Grapin et al., 1998). La propagación masiva de plantas a través de propágalos obtenidos vía embriogénesis somática es la más atractiva aplicación comercial de este proceso morfogénico (Merkle et al., 1990). El empleo de la embriogénesis somática permite obtener producciones superiores en un menor período de tiempo y a un costo más bajo, lo cual hace que este método sea potencialmente más eficiente que la regeneración vía organogénesis (Ibaraki y Kurata, 2001). Schoots et al.(1999) plantean que aunque la embriogénesis somática en banano esta bien establecida, aún no puede considerarse como un procedimiento común. Daniels et al (2002), lograron la formación, maduración y germinación de embriones somáticos en el cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB), utilizando medio de cultivo semisólido. Sin embargo dada la importancia económica creciente del cultivar híbrido de plátano vianda FHIA-21 se consideró necesario desarrollar la embriogénesis somática en medios de cultivo líquido en este cultivar. Teniendo en cuenta que los medios de cultivo líquido permiten la automatización con el uso de biorreactores, es posible la crioconservación de agregados celulares embriogénicos y la germinación de embriones somáticos en sistemas de inmersión temporal (Gómez et al., 2002). Introducción 4 La embriogénesis somática en medios de cultivo líquido ha sido descrita en los cv. Grande naine (Gómez et al., 1999) en FHIA-18 (Gómez et al., 2002) y recientemente en Navolean por López (2006). Por los aspectos anteriormente señalados y con el objetivo de optimizar la propagación in vitro a través de la embriogénesis somática en el cultivar híbrido FHIA- 21, se planteó la siguiente hipótesis de trabajo: “Es posible mediante el estudio de la densidad de inóculo en el cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB) lograr la formación, maduración y germinación de embriones somáticos en medios de cultivos líquidos”. Para dar cumplimiento a esta hipótesis en el presente trabajo se establecieron los siguientes objetivos: - Evaluar el efecto de la densidad de inóculo en la formación y maduración de embriones somáticos en medio de cultivo líquido. - Determinar el efecto de la densidad de inóculo en la germinación de embriones somáticos en medios de cultivo líquido. Revisión Bibliográfica 5 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 2.1. Origen El origen del género Musa se ha considerado a la península Malaya en Asia, tanto de Musa balbisiana como de Musa acuminata cuyos cruzamientos dieron origen a todas las variedades comerciales. En cuanto a la introducción a América, el cronista Oviedo sostiene que el plátano fue llevado desde la Gran Canaria a Santo Domingo por Fray de Berlanga en 1516 y de ahí a Cuba. La generalización de este cultivo en la América Intertropical fue debido a la facilidad de propagación y diversas formas de consumo y a la aptitud para producir bebidas fermentadas a partir de la pulpa madura (López, 1989). 2.2. Sistemática y botánica El plátano es una planta monocotiledónea y pertenece al orden Escitaminales, a la familia Musácea, subfamilia Musoideae y al género Musa. El género Musa contiene entre 30 y 40 especies diploides (2n=14, 18, 20, 22).En la actualidad, solo dos especies tienen importancia comercial: Musa acuminata (plátano) y Musa balbisiana (banano) (Placencia et al., 2006). Según Simmonds (1987), un paso importante en la evolución de los bananos comestibles fue el desarrollo de la partenocarpia y la esterilidad de las semillas, bajo la selección realizada por el hombre, originando los cultivares diploides comestibles de M. acuminata (AA), a partir de los cultivares AA, por restitución cromosómica en la meiosis surgieron los triploides AAA. Del cruzamiento entre los cultivares AA y AAA, con el silvestre M. balbisiana (BB), surgen los híbridos AB, AAB, ABB, AAAB, AABB. Revisión Bibliográfica 6 Es una planta herbácea, con un falso tallo de forma cilíndrica formado por las vainas de las hojas superpuestas, un cormo y un sistema radical fibroso. (López, 1989). 2.3 Cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB). Durante las últimas décadas, La Fundación Hondureña de Investigación Agrícola (FHIA) ha trabajado en el mejoramiento genético del género Musa (FHIA, 2002).Los híbridos obtenidos por la FHIA se están utilizando en más de 50 países, que encuentran en ellos una excelente alternativa alimenticia por su elevado potencial productivo y por sus bajos costos de producción debido a la resistencia genética a enfermedades, el banco de germoplasma de musáceas de la FHIA es considerado actualmente la colección viva de referencia de musáceas más grande de América Latina, y ha sido la fuente de material propagativo de germoplasma de interés a instituciones de diferentes países en América, así como la fuente de los genes deseados para la generación de los híbridos de banano y plátano desarrollados por la FHIA. está constituido por unos 400 diferentes genotipos (FHIA ,2007). Debido a la aparición en Cuba de la enfermedad Sigatoka negra, causada por el hongo Mycosphaerella fijiensis, Morelet las áreas dedicadas al cultivo de los plátanos del grupo AAB, se han ido reemplazado progresivamente por los bananos de cocción (ABB) y por híbridos tetraploides introducidos de la Fundación Hondureña de Investigaciones Agrícolas (FHIA) (Pérez, 1998). Revisión Bibliográfica 7 Uno de los cultivares híbridos desarrollado por esta fundación es el cultivar hibrido de plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB), cuya ficha descriptiva aparece a continuación (FHIA, 2002). Origen: FHIA, Honduras, Centro América Nombre del mejorador: Phillip Rowe Tipo: Plátano tipo Francés Año de generación: 1987 Nombre código: FHIA SH-3460 Linaje: AVP-67 (AAB) X SH-3142 (AA) Genoma/Ploidía: AAAB Uso: Consumo procesado (hervido o frito, verde o maduro) Características de la planta: Morfológicas: Hábito foliar: decumbente Apariencia del seudotallo: brillante (no ceroso) Altura: 3.5-4.0 m Tipo de bellota: normal (presente permanentemente) Forma de racimo: asimétrico Posición del racimo: ligeramente inclinado Color de fruto: verde claro Forma de fruto: recto en la parte distal Forma ápice del fruto: ligeramente puntiagudo Fenológicas: Revisión Bibliográfica 8 Duración primer ciclo vegetativo (siembra a floración): 240-280 días Duración primer ciclo productivo (parición a cosecha): 85-100 días Días transcurridos de siembra a segunda floración: 540-570 días Producción: Peso neto (sin raquis) de racimo: 22-27 kg Número de dedos por racimo (sin desmane): 120-150 dedos Número de dedos/racimo (con desmane a 5 manos): 70-80 dedos Peso dedos individuales (con desmane a 5 manos): 250-350 g Reacción a enfermedades: Sigatoka negra: Altamente resistente Mal de Panamá: Resistente Nemátodos: Susceptible a Radopholus similis y Pratylenchus coffea Pudrición de corona: Desconocida Descripción del sitio de evaluación: Localización: Latitud N15° 2131 Longitud O 87° 5635 Precipitación Pluvial Anual: 1000 a 1200 mm Temperatura Promedio Anual: 26°C Altura Promedio: 25 msnm 2.4. Embriogénesis Somática 2.4.1. Generalidades. La embriogénesis somática es la formación de un embrión, a partir de una célula o grupos de ellas sin la necesidad de la fusión de gametos (Merkle et al., 1995). Revisión Bibliográfica 9 Los pioneros de la embriogénesis somática in vitro fueron Levine (1950) y Wiggans (1954). Ellos describieron la formación de yemas y estructuras proembriogénicas en Daucus carota después de disminuir las concentraciones de auxinas iniciales en el medio de cultivo. También fueron los primeros en demostrar la totipotencia en células somáticas de plantas. .El primer informe sobre la técnica de embriogénesis somática en musácea le corresponde a Cronauer y Kriokorian (1983),quienes lograron obtener embriones a partir de suspensiones celulares derivadas de ápices vegetativos in vitro. Según Strosse et al (2003), esta técnica se basa en el uso de reguladores sintéticos de crecimiento (auxinas) para inducir la diferenciación de los tejidos y formación de tejido embriogénico (callo).El callo proporciona el material de inicio para el desarrollo de suspensiones de células embriogénicas (SCE), a partir de estas suspensiones, embriones son producidos y plantas son regeneradas. La fuente de explantes iniciales para la inducción de este proceso, constituye uno de los factores más importantes que pueden determinar el éxito o fracaso de la mayoría de las metodologías de regeneración de plantas vía embriogénesis somática. La embriogénesis somática ha sido descrita para un amplio número de plantas (Schoofs, 1997), sin embargo, la inducción de embriones somáticos y la regeneración de plantas aún no es rutina, ni eficiente para la mayoría de las especies. Merkle et al. (1995) plantearon que mientras más cerca llega el patrón de la expresión génica del embrión somático al de embrión cigótico, más alta será la posibilidad de obtener un sistema de regeneración altamente eficiente. Revisión Bibliográfica 10 El empleo de la embriogénesis somática permite obtener producciones superiores en un menor período de tiempo y a un costo más bajo, lo cual hace que este método sea potencialmente más eficiente que la regeneración vía organogénesis (Ibaraki y Kurata, 2001). 2.4.2. Características generales de la embriogénesis somática Según Sannasgala (1989); Escalant y Teisson (1989), el embrión somático presenta las siguientes características: Tiene autonomía frente al tejido generador (protegido generalmente por una epidermis). Histológicamente se plantea que no tiene conexión vascular con el tejido que le dio origen, por lo que pueden ser separados fácilmente de éste. Es una estructura bipolar con un ápice radical, apical y cotiledones. Presenta bandas procambiales entre los ápices. La inducción del estado embriogénico incluye la inducción de los mismos mecanismos genéticos que conllevan a la embriogénesis cigótica. Contrariamente a los embriones cigóticos, los embriones somáticos no contienen un nuevo grupo de genes, sino que poseen la misma combinación genética de la planta fuente del explante.( Parrott ,1993). 2.4.3. Factores que influyen en la embriogénesis somática Revisión Bibliográfica 11 El genotipo El tipo y el estado fisiológico del explante Los reguladores del crecimiento Las condiciones de cultivo 2.4.3.1. El genotipo. La embriogénesis somática debe ser un fenómeno universal para todas las plantas que producen semillas. No obstante, genotipos individuales dentro de una especie pueden variar grandemente en su capacidad embriogénica. Tales diferencias de genotipo pueden deberse a la habilidad para activar elementos fundamentales en la ruta embriogénica (Merkle et al., 1995). Escalant et al. (1994), plantean que los bananos y plátanos tienen una respuesta embriogénica muy variable a menudo extremadamente baja, aún cuando las flores sean recolectadas en la estación correcta. Varios autores han reportado sobre la dependencia del genotipo (Ivanova et al., 1994; Baker et al., 1995). No solo la respuesta embriogénica depende del genotipo y del cultivo, también diferentes clones pueden comportarse de manera diferente e incluso existe una gran variedad entre los experimentos (Schoofs et al.,1999). 2.4.3.2. El tipo y estado fisiológico del explante. Revisión Bibliográfica 12 La selección del explante puede ser un factor fundamental que determina el fracaso o el éxito de un protocolo embriogénico (Krishnaraj y Vasil, 1995). Sin embargo Strosse et al. (2003) plantean que el principal problema de utilizar los bananos comestibles (y por lo tanto sin semilla) consiste en que las células embriogénicas deben ser iniciadas de los tejidos diferenciados, por esto es necesario iniciar cientos de explantes (flores o escalpos) para obtener un callo embriogénico de buena calidad Para plantas de banano fueron probados cuatro procedimientos cada uno para diferentes tipos de explantes: embriones cigóticos rebanadas de rizoma y vainas foliares, flores inmaduras masculinas o femeninas y cultivos de multiyemas (domo meristematico).Por lo general las suspensiones celulares embriogénicas se inician de las flores masculinas inmaduras o escalpos (Strosse et al.2003). 2.4.3.3. Los reguladores del crecimiento. El ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D), es la auxina más común aplicada para inducir la embriogénesis somática, el éxito de esta en la inducción de la embriogénesis somática, ha sido atribuido a la potencia de la misma (Schoofs, 1997). La concentración de auxina y el tipo necesarios para inducir la embriogénesis somática depende altamente de la especie y el tipo de explante. En general, las monocotiledóneas y especialmente las Poaceae, necesitan auxinas fuertes a altas concentraciones a diferencia de especies dicotiledóneas (Vasil, 1985). Revisión Bibliográfica 13 Lerma et al. (2002), estudiaron el efecto de los reguladores del crecimiento en la calidad de la suspensión celular, obteniendo que para Musa AAA cv. Grande naine, la dosis para la eficiencia del proceso embriogénico es de 1,0 mg.l-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) como auxina exógena, las observaciones morfológicas revelaron que el procedimiento permitió el desarrollo de células viables que progresaron fácilmente hacia la formación de embriones. Sin embargo Daniels et al. (2002) para el cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa sp. AAAB) obtuvieron que la mejor concentración de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) resulta ser 3,0 mg.l-1 2.4.3.4. Las condiciones de cultivo. Las condiciones de temperatura e intensidad luminosa óptimas, ciertamente varían de especie a especie. Inflorescencias inmaduras fueron cultivadas en la oscuridad o a bajas intensidades luminosas en Phoenix dactylifera (Bhaskaran y Smith, 1992). Strosse et al. (2003), plantean algunas sugerencias para optimizar la embriogénesis somática en bananos: optimización del material de inicio, cambios de las condiciones osmóticas del medio de cultivo, cambio en la concentración de las auxinas, adición de compuestos que inducen la embriogénesis como aminoácidos y poliaminas. 2.4.4. Fases de la embriogénesis somática Inducción de la embriogénesis somática Establecimiento y mantenimiento de células en suspensión. Revisión Bibliográfica 14 Formación de embriones somáticos Maduración de los embriones somáticos. Germinación y conversión en plantas. 2.4.4.1. Inducción de la embriogénesis somática Los reguladores de crecimiento u otros factores estresantes son imprescindibles para la inducción de la desdiferenciación, división celular y para determinar el estado embriogénico, a estas células se le denominan células inducidas embriogénicamente. La inducción de la embriogénesis somática, a partir de estas células, es indirecta porque hay una fase de callos intermedia. La distancia epigenética de las células del explante al estado embriogénico va a determinar si el proceso es directo o indirecto (Merkle et al., 1995). En los plátanos y bananos el proceso de la inducción de la embriogénesis depende del cultivar y el método utilizado, la frecuencia más alta de los callos embriogénicos usualmente se observa después de 3 meses de cultivo cuando se utilizan flores masculinas inmaduras (Strosse et al., 2003). Algunos autores como Ziv (2005), plantean que los retardantes del crecimiento intervienen en la formación de los callos. 2.4.4.2. Establecimiento y mantenimiento de células en suspensión. En la mayoría de los cultivos se emplean, como material de partida para el establecimiento de suspensiones celulares, callos con embriogénesis somática de alta Revisión Bibliográfica 15 frecuencia y/o embriones somáticos obtenidos, en etapas iniciales de desarrollo (Gómez, 1998). Uno de los más poderosos aspectos de la embriogénesis somática que permite su aplicación en la propagación masiva y la transferencia de genes, es la habilidad de los cultivos embriogénicos de muchas especies de plantas a proliferar o multiplicarse indefinidamente (Merkle et al., 1995). Según Shoofs et al (1999) en los plátanos y bananos generalmente las suspensiones jóvenes requieren una muy alta densidad de inóculo inicial y renovación frecuente del medio de mantenimiento (cada tres a siete días) durante los primeros meses, pudiendo existir diferencia en el comportamiento de distintas líneas celulares del mismo clon lo que puede ser una característica intrínseca del material. La diferenciación de las células individuales que se desprenden de los agregados de las células embriogénicas y callos nodulares, se realizan rápidamente, seguida por su degeneración y oxidación, estas células deben ser renovadas lo más pronto posible en cada subcultivo, ya que tales células tienden a inducir una diferenciación general de células y tejidos, así mismo se debe renovar los agregados muy grande y los embriones somáticos más desarrollados ,ya que ellos tienden a acumular el almidón en sus células exteriores, estos embriones abortados luego empiezan a producir altas cantidades de fenoles. Después de seis meses, buenas suspensiones embriogénicas, aunque todavía heterogéneas en su aspecto, consistirán principalmente en manojos de células embriogénicas (Shoofs et al. 1999). Georget. et al. (2000), plantean que la calidad de una SCE disminuye con el número de subcultivos, esto produce como resultado una creciente probabilidad de contaminación y Revisión Bibliográfica 16 una disminuida tasa de crecimiento y capacidad de regeneración, debido, por ejemplo, a la invasión de las células densas de rápido crecimiento ricas en almidón. También se han realizado estudios sobre el suministro de carbono para el buen desarrollo de las suspensiones, Lerma et al., (2002) plantean que 30 g.l-1 de sacarosa es suficiente para el desarrollo de la misma. Gómez et al. (1999), lograron establecer suspensiones celulares embriogénicas en el cultivar Grande Naine Musa (AAA) a partir de callos obtenidos de las flores masculinas inmaduras. En el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB), se establecieron suspensiones celulares embriogénicas utilizando como explante inicial embriones somáticos en etapa globular, a los 10 días de establecidas las suspensiones observaron células embriogénicas pequeñas, esféricas con un contenido citoplasmático denso y granulo de almidón y proembriones, las suspensiones celulares en la fase de multiplicación estaban compuestas por un gran número de células esféricas en división activa, y agregados celulares heterogéneos, e irregulares, traslúcidos y no traslúcidos (Gómez et al., 2000). Daniels et al. (2002), lograron el establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas en el cultivar híbrido “FHIA-21”. Strosse et al.,(2003) señala que una suspensión celular embriogénica de buen calidad tiene las siguientes características: presencia de una alta proporción de agregados de células embriogénicas proliferantes, color que generalmente varia de amarillo brillante a pálido ,una rápida precipitación de células cuando la suspensión es removida del vibrador orbital, indicando una alta densidad del contenido celular, tasa de multiplicación entre 1,5 y 2 por un período de subcultivo de dos semanas y una alta capacidad de regeneración. Revisión Bibliográfica 17 2.4.4.3. Formación de embriones somáticos. Schoofs (1997), plantea que altas concentraciones de auxinas no bloquean la formación temprana del embrión, ya que la embriogénesis directa ocurre en la presencia de auxinas, la auxina, sin embargo, bloquea el desarrollo del embrión más allá de cierta etapa y frecuentemente evita la transición de la etapa globular a corazón, este autor planteó que el genotipo influye en la respuesta embriogénica. Daniels et al. (2002) en el cultivar híbrido FHIA-21 (Musa spp. AAAB), emplearon el medio de cultivo semisólido propuesto por Bieberach (1995), el que contenía las sales SH (1972), junto con otros componentes y reguladores del crecimiento, los cuales lo hicieron mucho más rico en su composición Estos elementos (reguladores de crecimiento) favorecen el proceso de la histodiferenciación de las células. Estos autores plantean que la capacidad de formación de embriones somáticos, también esta relacionada con la edad de la suspensión cedular las que se mantuvieron hasta los 14 meses en suspensión tuvieron la máxima capacidad de formar embriones somáticos. A partir de los 16 meses de cultivo, la capacidad de estas suspensiones celulares disminuyó con diferencia significativa a las suspensiones celulares más jóvenes. La capacidad de estas suspensiones celulares siguió disminuyendo a los 18 y 20 meses de edad, donde solo se formaron 584,70 ± 5.87 embriones somáticos . Otro aspecto a tener en cuenta para facilitar la formación y la sincronización de los embriones somáticos consiste en tamizar los agregados celulares y lavar éstos antes de su inoculación, para eliminar residuos del medio de cultivo anterior (Arnold et al., 2002). López (2006) logro la formación de embriones somáticos en el cultivar Navolean (AAB), en medio de cultivo líquido y semisólido. Cabrera et el. (2002) en este mismo cultivar obtuvo embriones en ambos estados físicos del medio de cultivo. Wong et al. (2006) Revisión Bibliográfica 18 estudiaron diferentes concentraciones de 6- BAP en la formación y diferenciación de embriones somáticos de bananos en medios de cultivo líquido y semisólido obteniendo los mayores resultados a medida que aumentaron la concentración de esta citoquínina. 2.4.4.4. Maduración de los embriones somáticos. La fase de maduración es el período en el desarrollo del embrión somático en el cual ocurre la expansión de la célula y la acumulación de sustancias de reserva (Bewley y Black, 1985). En esta etapa juegan un papel fundamental la presencia de nitrógeno en el medio de cultivo, siendo necesaria la adición al mismo de nitratos, amonios, aminoácidos y caseína hidrolizada. Los carbohidratos entre ellos la sacarosa en concentraciones de 3.0-6.0% son esenciales, junto a bajas concentraciones de oxígeno en el medio, lo cual permite una total maduración y evita la germinación precoz. Como marcadores de la calidad del desarrollo del embrión somático se han utilizado distintas sustancias de reserva, tales como la acumulación de proteínas, lípidos y almidón, aunque este último ha sido menos estudiado (Merkle et al., 1995). La adición de ABA durante la etapa de maduración del embrión, promueve la acumulación de sustancias de reserva, esto, seguido de un apropiado tiempo de secado, puede lograr un mejor crecimiento y desarrollo de los embriones somáticos y también previene la germinación precoz (Kärkönen, 2000). La necesidad de esta fase de maduración de los embriones somáticos fue corroborada por Cabrera et al. (2002) en el cultivar de plátano vianda Navolean (Grupo AAB) cuando utilizaron las multiyemas como explante inicial. En este mismo cultivar se comprobó que Revisión Bibliográfica 19 cuando los embriones somáticos no fueron cultivados previamente en el medio de maduración, solo germinó el 18,60% de los mismos (López 2006). El uso de las citoquíninas en el medio de cultivo juega un papel importante en la maduración de los embriones somáticos, lo cual ha sido demostrado por varios autores (Akula et al., 2000;Onay et al., 2000; Sarasan et al.,2001;Lee et al., 2002)En especial el 6- BAP ha sido muy empleado en varias especies de plantas; Schuller et al.(2000),incrementaron el número de embriones y su maduración con el uso de esta citoquínina. 2.4.4.5. Germinación y conversión en plantas. La germinación es muy importante en el proceso de la embriogénesis somática y es diferente de la conversión. La germinación se refiere al desarrollo de la raíz y/o brote, mientras que la conversión se define por Stuart y Strickland (1984) como la supervivencia y desarrollo en fase de propágulo en condiciones ambientales ex vitro, o sea, en suelo. En en el cv “Grande naine” Gómez el al.(1999) utilizaron Sistemas de Inmersión Temporal, para la obtención de plantas completas a partir de embriones somáticos y lograron un 77,4% de germinación a los dos meses del cultivo.Se han realizado estudios sobre el e el efecto de los brasinoesteroide (Biobras-6) en la germinación de los embriones somáticos en el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB) donde con la adición de 0.01 mg.L-1 al medio de cultivo se obtuvieron los mayores porcentajes de germinación, estos resultados demuestran el efecto estimulador del mismo en este proceso (Gómez et al.,2000). Los brasinoesteroides pueden acelerar el crecimiento y la maduración de las plantas, además estos compuestos interactúan con otros reguladores del crecimiento endógenos y con señales ambientales, particularmente con la calidad de la luz, las Revisión Bibliográfica 20 respuestas a los brasinoesteroides incluyen otros efectos como en la elongación, la división celular, el desarrollo vascular y reproductivo, la polarización de la membrana y el bombeo de protones, las relaciones fuente/sitio de consumo y la modulación del estrés (Núñez y Robaina, 2000). Gómez et al. (2002) en el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB) lograron altos porcentajes de germinación en medio de cultivo líquido En el cultivar Navolean (Grupo AAB) López (2006), logró también altos porcentajes de germinación de los embriones somáticos de con el uso combinado de los embriones somáticos maduros en el sistema de inmersión temporal tipo RITA. Estos resultados indican que el genotipo influye en el proceso de la germinación. 2.5. Influencia de la densidad de inóculo en el desarrollo de la embriogénesis somática en Musa spp. Se ha demostrado que uno de los parámetros de cultivo que define el comportamiento de las suspensiones celulares es la densidad de inóculo (Merkle et al., 1995). A mayor densidad celular, mayor competencia entre las células por los elementos nutritivos en el medio de cultivo, también las células compiten por el espacio para su desarrollo, en suspensiones celulares embriogénicas de plátanos, el desarrollo de células embriogénicas en pro-embriones en medio de cultivo líquido es bajo y dentro de las señales que resultan en la formación de embriones somáticos, la densidad celular es considerada un factor importante (Georget et al., 2000). Osuga (1994), en Zanahoria (Dacus carota L.), estudió la importancia de la densidad de inoculo en la formación de los embriones somáticos y su sincronización obteniendo el Revisión Bibliográfica 21 mayor número de embriones somáticos formados cuando utilizó entre 14,0 y 16,0 % de densidad celular. Gómez et al. (1999) con un 15,0% de células obtuvieron embriones somáticos en etapa globular en el cv. Grande naine, a los 45 días de cultivo en medio de cultivo liquido. En estudios realizados en el cultivar híbrido FHIA-21 (Musa sp. AAAB), Daniels et al. (2002), obtuvieron embriones somáticos después de 45 días de cultivo en medio de cultivo semisólido propuesto por Bieberach (1995). En estudios realizados por Gómez et al. (2000) en el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB) donde se empleo medio de cultivo líquido en agitación para la maduración y diferentes densidades de inóculo, estos autores observaron una rápida maduración de los embriones entre los 15,0 y 20,0% en las densidades mas bajas estudiadas, sin embargo al utilizar densidades altas no se observo maduración de los embriones somáticos estos se mantuvieron en etapa globular, esto demuestra la relación estrecha que existe entre la densidad inicial de embriones somáticos y el proceso de maduración, lo cual también indica que hay mayor acumulación de sustancias de reserva y menor multiplicación al utilizar densidades bajas. En este mismo cultivar mencionado anteriormente Gómez et al. (2002), lograron la mayor cantidad de embriones en medio de cultivo líquido con una densidad de inóculo 100 mg de agregados celulares a los 30 días de cultivo, el diámetro de estos embriones somáticos varió entre 0,5 a 1, 2 mm, en cuanto al peso promedio se estimó a 0,73 ± 0,16 mg. En el cultivar de plátano vianda Navolean (Grupo AAB) el efecto de la densidad de inóculo inicial de embriones, el medio de cultivo y el tiempo de permanencia en el mismo favoreció la maduración (López, 2006). Revisión Bibliográfica 22 Daniels et al. (2002), señalan que existe relación entre la densidad celular, la formación de los embriones somáticos y el inicio de la germinación de los mismos, así como el tiempo de permanencia de estos en el medio de cultivo de maduración. Estos autores plantean que con 15,0% de densidad celular se logran los mayores porcentajes de germinación en medio de cultivo semisólido después de permanecer más de 20 días en el medio de cultivo de germinación en el cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB). En cuanto a la influencia de la densidad de inóculo inicial de embriones somáticos sobre la germinación en Sistemas de Inmersión Temporal tipo RITA en el cultivar híbrido FHIA- 18 (AAAB) cuando se utilizaron densidades de inóculo altas se obtuvieron porcentajes de germinación bajos (17%), esto se debe a que al haber un número mayor de embriones la competencia por las sustancias nutritivas y el oxígeno es mayor dentro del RITA (Barranco, 2001). Teniendo en cuenta que todos los genotipos no presentan igual comportamiento en el desarrollo de la embriogénesis somática y que todos no se han desarrollado en medios de cultivo líquido se hace necesario continuar estudios sobre el tema. . Revisión Bibliográfica 23 Materiales yMétodos 23 3. MATERIALES Y METODOS El presente trabajo se realizó en el Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP), adscrito a la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas (UCLV), Santa Clara, Cuba. El mismo se llevó a cabo durante el período comprendido entre enero de 2006 a diciembre de 2007. Procedimientos generales de trabajo Material vegetal Como material vegetal se utilizaron flores masculinas inmaduras del cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB), previamente colectadas de plantas en el campo, de 1 a 10 semanas después del inicio de la floración. Instrumental La esterilización del instrumental (filtros, placas de Petri, pipetas, espátulas, pipetas Pasteur, platos) utilizados en la manipulación de las suspensiones celulares, se realizó en una estufa a 180ºC durante dos horas. Las pinzas y los bisturís se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1,0% (p/v) durante 15 minutos (Agramonte et al., 1993). Los Erlenmeyers utilizados en los cultivos de las suspensiones celulares, así como las puntas de pipetas SOCOREX se esterilizaron en autoclave a 121 ºC y a 1,2 kg.cm-2 de presión durante 40 minutos. Para los trabajos con suspensiones celulares se utilizaron pipetas cortas de vidrio de 5.0 y 10 ml de volumen y una pipeta automática modelo PIPETBOY (TECNOMARA). Las Materiales yMétodos 24 operaciones de inoculación, transferencia y manipulación del material vegetal se realizaron bajo en una cabina de flujo laminar horizontal. Medios de cultivo Los medios de cultivo se esterilizaron en una autoclave a 121 ºC de temperatura y 1,2 kg.cm-2 de presión. El tiempo de la esterilización estuvo en dependencia del volumen de medio de cultivo, según SIGMA (1991). El pH fue ajustado con el uso de ácido clorhídrico (HCl) 1,0 M y/o hidróxido de sodio (NaOH) 1,0 M, previo a la esterilización. . Formación de callos con estructuras embriogénicas Las flores masculinas inmaduras fueron extraídos bajo un microscopio estereoscópico, y colocados en frascos de vidrio de 250 ml de capacidad .Se utilizó el medio de cultivo propuesto por Escalant et al. (1994), el cual contenía las sales MS (Murashige y Skoog, 1962), las vitaminas MS, 1,0 mgl -1 de biotina, 5,71µMl -1 de ácido indol-3-acético (AIA), 5,37 µMl -1 de ácido naftalenacético (ANA), 18,1 µMl -1 l -1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y 30 gl-1 de sacarosa. El mismo fue gelificado con 2,3 gl -1 de Gelrite ® (SIGMA) y ajustado a pH de 5,8 previo a la esterilización (SIGMA 1991). Los frascos de cultivo fueron sellados con parafilm y se mantuvieron en la oscuridad total a una temperatura de 27±2,0 ºC durante cinco meses sin la realización del subcultivo. A partir del tercer mes del cultivo se hicieron observaciones para Materiales yMétodos 25 determinar el momento de aparición de callos con estructura embriogénica que se utilizaron en el establecimiento de las suspensiones celulares. Establecimiento de suspensiones celulares embriogénicas Para iniciar las suspensiones celulares se inocularon 150 mg de masa fresca (mgMF) de agregados celulares embriogénicos del cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa spp. AAAB) en Erlenmeyers de 25 ml de volumen total, con 2,0-3,0 ml de medio de cultivo líquido propuesto por Bieberach (1995) y modificado por Daniels et al (2002). Este medio de cultivo estuvo compuesto por las sales MS (Murashige y Skoog, 1962), las vitaminas MS, 0,5 mgl -1 de biotina, 100 mgl -1, L-glutamina, 100 mgl -1 de extracto de malta, 13,57µMl -1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y 45 gl -1 de sacarosa. El pH fue ajustado a 5,3 previo a la esterilización. Los Erlenmeyers fueron colocados en un agitador orbital modelo INFORS (HT), bajo condiciones de oscuridad, velocidad de 90 rpm y temperatura de cuarto controlada a 27±2,0 ºC. A los 15 días, las suspensiones celulares formadas a partir de los embriones somáticos, fueron tamizadas a través de filtros de malla metálica con un tamaño de poro de 500 m. Los filtrados contenían agregados celulares embriogénicos, los cuales fueron multiplicados en Erlenmeyer de 250 ml de capacidad a una concentración del 3%. Las suspensiones celulares embriogénicas constituyeron el material de partida de los diferentes experimentos durante el desarrollo de la embriogénesis somática en medios de cultivo líquido. Los embriones somáticos (residuos) fueron recuperados y transferidos de nuevo a Erlenmeyers de igual Materiales yMétodos 26 capacidad y con la misma cantidad de medio de cultivo, para la obtención de nuevas suspensiones celulares. Cada siete días se renovó la mitad del medio de cultivo. Para la determinación del crecimiento de las suspensiones celulares se utilizó el método del volumen de células sedimentadas (VCS) (Schoofs, 1997). 3.1. Efecto de la densidad celular en la formación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido. Con el objetivo de evaluar la influencia de la densidades celulares en la formación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido a partir de las suspensiones celulares embriogénicas en fase de multiplicación del cultivar híbrido FHIA-21. Se estudiaron cuatro densidades celulares (1,0; 2,0; 3,0 y 4,0%) de volumen de células sedimentadas (VCS). Para ello se emplearon Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, con 30ml de medio de cultivo para la formación de embriones somáticos, utilizando 5 Erlenmeyer por cada densidad estudiada. Se utilizó el medio de cultivo de Schenk e Hildebrandt (1972) modificado por Bieberach (1995), el cual contenía las sales SH (Schenk e Hildebrandt,1972) a 100%, vitaminas MS 100%, 1,0 mg.l -1 de biotina, 100 mg.l -1 de extracto de malta, 100 mg.l -1 de L-glutamina, 230 mg.l-1 de L-prolina, 10 g.l-1 de lactosa, 0,23 µM.l-1 de zeatina, 100 mg.l-1 de mioinositol, 0,07 µM.l-1 de ácido naftalenacético (ANA), 0,98 µM.l-1l de isopenilaminopurina (2ip), 0,46 µM.l-1 de Kinetina y 45 g.l -1 de sacarosa. Cada 15 días se les renovó el 50% del medio de cultivo. Las condiciones de cultivo utilizadas fueron descritas en procedimientos generales. Materiales yMétodos 27 Las evaluaciones se realizaron cada dos días a partir de los 15 días de cultivo y se determinó visualmente la aparición de los embriones somáticos. Además se evaluó el número y tamaño de los embriones por cada densidad celular establecida. Para el conteo del número de embriones somáticos formados a los 45 días de cultivo, se tomaron 500 l del cultivo con embriones somáticos y se adiciono a un vaso de precipitado de 50 ml de capacidad, que contenía 30 ml de una mezcla de Gelrite ® (SIGMA), (2,3g.l-1) y agua. Posteriormente se vertió la mezcla en una placa de Petri de 70 mm de diámetro, se tapo y se dejo solidificar, luego se dividió en cuatro cuadrantes con la ayuda de una regla graduada y marcador cristalográfico, quedando conformados 12 repeticiones por densidad estudiada. El conteo se realizó bajo el microscopio estereoscópico modelo WILD M8 (LEICA). Para medir el tamaño de los embriones somáticos en cada una de las densidades estudiadas se tomaron 100 l de cultivo con embriones y se siguió el mismo procedimiento y número de repeticiones que para el conteo, las placas se dividieron en cuatro cuadrantes. Las mediciones se realizaron con una escala micrométrica bajo el microscopio estereoscópico modelo WILD M8 (LEICA). Análisis estadístico La comparación de las medias del número de embriones somáticos se realizó por un análisis de varianza simple y se empleó la prueba de Dunnett C a través del paquete estadístico SPSS versión 15,0. Materiales yMétodos 28 3.2. Efecto de la densidad de inóculo en la maduración de embriones somáticos en medio de cultivo líquido. El presente experimento se realizó con el objetivo determinar el efecto de la densidad de inóculo en la maduración de embriones somáticos en medio de cultivo líquido. Para ello, se establecieron cuatro densidades de inóculo: 200, 400, 600 y 800 mgMF de embriones somáticos en etapa globular en 30 ml de medio de cultivo líquido. Estos fueron cultivados en Erlenmeyer de 250 ml de capacidad con cinco repeticiones por cada tratamiento en el medio de cultivo líquido de maduración propuesto por Gómez et al (2000). Este medio contiene las sales MS 100%, las vitaminas MS 100%, 1.0 mg.l -1de Biotina, 2,22 µM.l -1de 6-bencilaminopurina (6-BAP), 5,71 µM.l -1de ácido indol-3-acético (AIA) y 45 g.l -1de sacarosa y el pH se ajustó a 5,8 antes de la esterilización. Las condiciones de cultivo fueron similares a las descritas en procedimientos generales. A los 30 días de cultivo se evaluó el tamaño de los embriones somáticos. Para ello se extrajo 1,0 ml de embriones en suspensión correspondientes a cada densidad de inóculo y se vertieron en placa de Petri, acorde a la descripción que se realizó en el acápite 3.1. Las mediciones se realizaron con una escala milimétrica bajo el microscopio estereoscópico modelo WILD M8 (LEICA). Se emplearon tres repeticiones por cada densidad. Para evaluar el porcentaje de germinación de los embriones somáticos provenientes del medio de cultivo de maduración, se tomaron de cada densidad estudiada embriones individuales colocando, se colocaron 20 embriones por frasco en medio de Materiales yMétodos 29 cultivo de germinación, propuesto por Gómez et al (2000), el cual contiene las sales MS, las vitaminas MS, 2,22 µM.l -1de 6-bencilaminopurina (6-BAP), 11,42 µM.l -1 de ácido indol-3-acético (AIA), 100 mg.l -1 de mio inositol, 0,01 mg.l -1 de Biobrás-6, y 30 g.l -1 de sacarosa, el medio de cultivo fue gelificado con 2,3 g.l -1 de Gelrite ® (SIGMA). El pH fue ajustado a 5,7 antes de la esterilización. Se colocaron 11 frascos de cristal de 250 ml de capacidad con 30ml de medio de cultivo por cada densidad. Los mismos fueron colocados en la cámara de crecimiento de luz artificial con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad, con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 42-48 µmol m-2 s-1y una temperatura de27±2,0ºC. El número de embriones germinados se evalúo a los: 10, 20 y 30 días de cultivo. Análisis estadístico Los datos del número de embriones germinados se analizó estadísticamente mediante una prueba no paramétrica de Kruskall Wallis previa comprobación de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza utilizando el paquete estadístico SPSS 15,0 sobre Windons. 3.3. Efecto de la densidad de inóculo en la germinación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido. Materiales yMétodos 30 3.3.1. Germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en agitación. Con el objetivo de evaluar la influencia de la densidad de inóculo en la germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en agitación se estudiaron cuatro densidades de inoculo: 800, 1000,1200 y 1400 mgMF de embriones somáticos en Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, a los que se adicionó 30 ml medio de cultivo liquido de germinación propuesto por Gómez et al (2000) y en las mismas condiciones de cultivo que se menciona en el epígrafe 3.2. Se emplearon cinco Erlenmeyer por tratamientos. A los 30 días de cultivo se evaluó el número de embriones germinados en cada una de las densidades estudiadas. 3.3.2. Germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en Sistemas de Inmersión Temporal (SIT). En los Sistemas de Inmersión Temporal (SIT), se evaluaron cuatro densidades de inóculo: 15, 20, 25 y 30 gMF de embriones somáticos, los que se colocaron en frasco de cristal, con una capacidad de 1750 ml adicionándole 200 ml del medio de cultivo líquido de germinación (Gómez et al. 2000). Los SIT fueron colocados en la cámara de crecimiento con luz solar a una densidad de flujo de fotónes fotosintéticas (DFFF) de 50 - 62.5 mol.m-2.s-1 y una temperatura de 27±2.0ºC. La frecuencia de inmersión fue de un minuto diario. A los 20 días se evalúo el número de embriones germinados en cada una de las densidades estudiadas. . Materiales yMétodos 31 Análisis estadístico Los datos del número de embriones germinados se analizaron estadísticamente mediante una prueba no paramétrica de Kruskall Wallis previa comprobación de los supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza utilizando el paquete estadístico SPSS 15,0 sobre Windons. Resultados y Discusión 32 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Efecto de la densidad celular en la formación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido Se alcanzaron diferencias significativas en el número de los embriones somáticos formados en cada una de las densidades celulares estudiadas (1,0; 2,0; 3,0 y 4,0% de VCS) (Tabla 1), a los 45 días en medio de cultivo líquido en agitación a partir de agregados celulares embriogénicos. Los mejores tratamientos fueron en los que se utilizó 3,0 y 4,0% de VCS de densidad celular (Figura 1), lográndose un total de 523,91 y 447,50 respectivamente, no existiendo diferencia significativa entre ellas. Tabla 1. Efecto de la densidad celular en el número de embriones somáticos formados en medio de cultivo líquido del cultivar híbrido FHIA 21 (Musa AAAB), a los 45 días de cultivo Densidad celular(VCS) % Media del número de embriones somáticos en 500 µl 1,0 93,91±23,18 c 2,0 335,66±23,18 b 3,0 523,91±21,28 a 4,0 447,50±26,42 a Letras desiguales en una misma columna difieren según la prueba de Dunnett C para p 0,05 Resultados y Discusión 33 Figura 1. Formación de los embriones somáticos del cultivar híbrido FHIA 21 (Musa AAAB) en 3,0 % de VCS en medio de cultivo líquido en agitación, a los 45 días de cultivo Daniels et al. (2002), evaluaron el efecto de la densidad de inóculo (10,0; 15,0; 20,0 y 25,0 % de VCS), logrando la formación embriones somáticos en todas, pero la mayor cantidad la obtuvieron con 15,0 y 20,0% de VCS, logrando 604,75± 5,36 y 799± 2,50 de embriones somáticos respectivamente, en medio de cultivo semisólido a los 45 días del cultivo, en el cultivar híbrido de plátano FHIA-21 (Musa AAAB). Varios autores han estudiado la influencia de la densidad celular en la formación de los embriones somáticos en otros cultivares de bananos y plátanos como Gómez et al. (2002) en medio de cultivo líquido en el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB), los que Resultados y Discusión 34 alcanzaron la mayor cantidad de embriones somáticos formados cuando utilizaron 100 mgMF por 25 ml de medio de cultivo. Cabrera et al. (2002) el medio de cultivo líquido propuesto por Dhed’a et al. (1991) en el cv. Navolean, alcanzaron los mejores resultados en el número de embriones somáticos formados en las densidades de células entre el 9,0 y 15,0% de VCS, tanto para el medio de cultivo líquido como para el medio de cultivo semisólido. López (2006) en este mismo cultivar obtuvo que los mejores tratamientos para la formación de los embriones somáticos fueron el 12,0 y 15,0% de VCS que propiciaron la formación de 1672,0 y 1373,5 embriones somáticos respectivamente, sin diferencia significativa entre ellos.Todo lo anteriormente señalado confirma el papel de la densidad celular durante el proceso de formación de los embriones somáticos. La densidad celular al igual que en el número de los embriones somáticos formados influyó en el tamaño de los mismos, disminuyendo este a medida que aumento la densidad celular. Los embriones somáticos presentaron diferentes grados de histodiferenciación, también asociado a la densidad celular inicial utilizada para su formación (Figura 2). Resultados y Discusión 35 Figura 2. Distribución del tamaño de los embriones somáticos del cultivar híbrido FHIA 21 (Musa AAAB) en las densidad celular estudiadas (VCS) en medio de cultivo líquido, a los 45 días de cultivo. De un total de 75 embriones somáticos en la densidad de 1,0% de VCS, que alcanzaron un tamaño que osciló entre 20 y 80 µm, la mayor cantidad (60), se encontraron en el rango de 50 a 80 µm, estos embriones somáticos se encontraban en etapa coleoptilar (Figura 3A). Los embriones somáticos formados en la densidad celular de 2,0% de VCS, su tamaño oscilo entre 20 y 100 µm, de un total 218 embriones 134 se encontraron en el rango de 50-80 µm, se observaron embriones en etapa coleoptilar, pero mostraron formación de embriones secundarios en etapa globular (Figura 3B). 0 100 200 300 400 500 600 1 2 3 4 Densidad celular (% de VCS) D is tr ib uc ió n de l t am añ o de lo s em br io ne s so m át ic os 100 µm 50-80 µm 20-40µm (1 00 µ l) Resultados y Discusión 36 En la densidad de 3,0% de VCS, los embriones somáticos alcanzaron un tamaño de 20 a 80 µm, de un total de 492, 410 se encontraron en el rango de 20-40 µm, en esta densidad se observó la formación de embriones somáticos y proembriones, los embriones en etapa globular con gran multiplicación secundaria (Figura 3C). En la densidad de 4,0% de VCS los embriones somáticos fueron de menor tamaño menores a 20 µm, observándose la presencia de proembriones con restos de agregados celulares (Figura 3D). (C) 3,0% (D) 4,0 % (A) 1,0% (B)2,0% Resultados y Discusión 37 Figura 3. Aspectos morfológicos de los embriones somáticos del cultivar híbrido FHIA 21(Musa AAAB), en medio de cultivo líquido, con 1,0% (A), 2,0% (B), 3,0% (C) y 4,0% (D) de VCS de densidad celular (barra=80 µm) El tamaño de los embriones somáticos obtenidos en el presente trabajo fue menor a lo informado por Gómez et al. (2002) en medio de cultivo líquido en agitación, pero en el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB) donde se obtuvieron embriones somáticos con un tamaño promedio de 0.86 ± 0.25 mm. Esto pudo a estar dado porque este autor utilizó densidades celulares menores a las evaluadas en este trabajo. Por los resultados alcanzados durante la fase de formación de los embriones somáticos se establece como condición de cultivo para el cv. FHIA 21 (Musa AAAB), iniciar el proceso a partir de suspensiones celulares embriogénicas a la densidad celular de 3,0% de VCS para medio de cultivo líquido. 4.2. Efecto de la densidad de inóculo en la maduración de embriones somáticos en medio de cultivo líquido En las diferentes densidades de inóculo estudiadas para la maduración de los embriones somáticos, a los 30 días en medio de cultivo líquido los embriones mostraron aumento de tamaño y diferentes aspectos morfológicos, todo esto relacionado con la densidad de inóculo utilizada (Tabla 2 y Figura 4). Resultados y Discusión 38 Los embriones somáticos cultivados durante la maduración en 200 y 400 mgMF de densidad de inóculo alcanzaron un mayor tamaño. Los embriones en estas densidades mostraron la presencia del primordio radical (germinación parcial). En estas densidades se observaron embriones con un tamaño mayor a 4 mm los que tuvieron un crecimiento anormal o fuera de tipo, como se muestra en la figura 5. Tabla 2. Tamaño de los embriones somáticos del cv. FHIA 21 (Musa . AAAB) en las distintas densidades de inoculo, a los 30 días de cultivo en medio de cultivo líquido de maduración. Densidad de inóculo (mgMF) de embriones somáticos en 30 ml Tamaño del embrión somático en 1,0 ml (mm) 1-1,5 1,5-2,5 2,5-4 4-6,5 6,5-8,5 200 -- 12,4 28,2 5,0 4,5 400 -- 44,2 14,8 8,2 7,6 600 52,2 10,2 -- -- -- 800 76,5 -- -- -- -- Los embriones que fueron cultivados en 600 y 800 mgMF de densidad de inóculo fueron de menor tamaño. En los embriones cultivados en estas densidades no se observan embriones fuera de tipo o con desarrollo anormal. Los embriones cultivados a 800 mgMF presentan oxidación fenólica, este aspecto morfológico puede ser causado por el cultivo a alta densidad. Resultados y Discusión 39 Figura 4. Aspectos morfológicos de los embriones somáticos del cv. FHIA 21(Musa AAAB), a los 30 días en medio de cultivo líquido de maduración. Densidad inicial de (A)-200 (B)-400 (B)-400 (A)-200 (C)-600 (D)-800 (A)-200 (B)-400 Resultados y Discusión 40 inóculo de 200 mgMF (A), 400 mgMF (B), 600 mgMF (B) y 800 mgMF (D) de embriones somáticos (barra 3,0mm) El porcentaje de germinación de los embriones en las cuatro densidades de inóculo estudiadas en maduración fue diferente, lo que se observó en las evaluaciones realizadas a los 10, 20 y 30 días (Figura 6). Figura 5.Embriones somáticos fuera de tipo presentes en en las densidades de 200 y 400 mg del cv. FHIA 21(Musa AAAB), a los 30 días en medio de cultivo líquido de maduración (barra 4,0mm) Resultados y Discusión 41 Letras desiguales difieren por prueba no paramétrica de Kruskall Wallis para p 0,05 Figura 6. Efecto de la densidad de inóculo en el medio de cultivo de maduración, sobre la germinación de los embriones somáticos en el cv FHIA 21(Musa AAAB) en medio de cultivo semisólido a los 10, 20 y 30 días de cultivo. El mayor porcentaje de embriones germinados se obtuvo cuando se utilizo la densidad de inóculo de 600mgMF embriones somáticos maduros, existiendo diferencia significativa con el resto de las densidades estudiadas en cada uno de los días evaluados (Figura7). 0 10 20 30 40 50 60 10 20 30 evaluaciones (días) Po rc en ta je d e e m br io ne s /fr as co 200 400 600 800 c bc a b b b a b c b a c Densidades de inóculo (mgMF) Resultados y Discusión 42 En la densidad de 200mgMF a los 10 días no existían embriones somáticos maduros germinados, llegando a obtenerse a los 30 días solo un 13,63% de embriones germinados. Cuando se utilizo la densidad de 400mgMF de embriones a los 10 días solamente se logró un 2,27%, alcanzándose a los 30 días un 30,45%. Al utilizar 600mgMF de embriones somáticos maduros, a los 10 días se alcanzó un porcentaje de 6,81% de embriones germinados, en esta densidad de inóculo el porcentaje de germinación siempre fue mayor al obtenido en el resto de las densidades estudiadas en todas la evaluaciones realizadas obteniéndose a los 30 días un 47,72% de embriones germinados. En la mayor densidad de inóculo estudiada (800mgMF), en la evaluación a los 10 días se obtuvo un porcentaje de germinación de 3,18%, obteniéndose a los 30 días un 19,09% de embriones maduros germinados. (B)-400 Resultados y Discusión 43 Figura 7. Embriones somáticos del cv. FHIA 21(Musa AAAB) germinados en medio de cultivo semisólido, a los 30 días de cultivo, en las cuatro densidades. (A200, B400, C600 y D800 mgMF). Respecto a los resultados obtenidos en el presente trabajo Gómez et al. (2000) informan que al estudiar el efecto de la densidad de embriones somáticos del cv FHIA 18 para la maduración de estos en medio líquido en agitación los mejores resultados se obtuvieron con la densidad de 800 mgMF. Donde se alcanzó una rápida (C)-600 (D)-800 (A) (B) (D) (C) Resultados y Discusión 44 maduración de los embriones somáticos. Sin embargo en la densidad de 400 mgMF se logró una mayor sincronización, pero el tiempo para la maduración de los embriones somáticos fue mayor. No obstante con densidades altas de 1000 mgMF los embriones somáticos nunca germinaron. Daniels (2002) en el cv. FHIA-21(Musa AAAB) durante la etapa de maduración de los embriones somáticos también observó que la densidad celular y el tiempo de permanencia en el medio de cultivo de maduración influyen en el número de los embriones somáticos germinados. Además, encontró que los embriones somáticos formados al 15% de densidad celular, después de 20 y 30 días de permanencia en el medio de cultivo de maduración lograron una germinación de 81,5 y 82,5% respectivamente. Barranco (2001) en el cv. FHIA-18 (AAAB) al utilizar densidades de embriones somáticos entre 0,4 y 0,8 gMF en 30 mL de medio de cultivo observó una rápida maduración, la cual ocurrió entre 15 y 22 días de cultivo. López (2006) en estudios realizados sobre la interacción de la densidad de inóculo inicial de embriones somáticos y el tiempo de incubación en el medio de cultivo de maduración en el cv. Navolean obtuvo que la mejor combinación fue la densidad de 0.5 gMF de embriones durante 30 días de cultivo, logrando un porcentaje de 46.80%.Se comprobó además por este autor, que cuando los embriones somáticos no fueron cultivados previamente en el medio de cultivo de maduración, sólo germinó el 18,60% de los mismos. Resultados y Discusión 45 En la literatura consultada se hace muy poca mención de esta etapa en el género Musa, debido al hecho de que al obtener embriones somáticos en etapa globular, son transferidos a medios de cultivo de germinación, lo cual provoca que se logren bajos porcentajes de embriones germinados (Gómez et al., 2000). Santos et al. (2002), también en el cultivar mencionado anteriormente, obviaron la fase de maduración de los embriones somáticos y obtuvieron sólo un 20,7% de germinación. Los embriones somáticos en etapa globular no están aptos para germinar y por tanto, necesitan ser colocados en un medio de cultivo específico para favorecer la maduración de los mismos y la correcta acumulación de sustancias de reserva. Fuji et al. (1990), plantearon que el vigor y poder germinativo de los embriones somáticos son favorecidos por la correcta absorción de sustancias nutritivas para culminar su desarrollo estructural y funcional, siendo necesario colocarlos a madurar. También se conoce que el peso o el tamaño de los embriones no son un indicio definitorio de la calidad o el grado de maduración de los mismos (Parrott, et al., 1988). Los embriones somáticos con mayor porcentaje de germinacón fueron los cultivados en 600 mgMF de densidad de inóculo durante la maduración, obteniendo un 47,72 % de germinación a los 30 dás de cultivo. A-200 B-400 Resultados y Discusión 46 4.3 Efecto de la densidad celular en la germinación de embriones somáticos en medio de cultivo líquido 4.3.1 Germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en agitación En este experimento donde los embriones somáticos se colocaron en medio líquido en agitación se obtuvieron valores bajos de embriones germinados entre 6 y 9 %, en las cuatro densidades de inóculo estudiadas, sin diferencias significativas entre ellas, lo cual confirma que la inmersión constante de los embriones en el medio de cultivo líquido no favorece la germinación de los mismos provocando problemas de hiperhidratación y falta de oxígeno (Alvard et al., 1993; Etienne y Berthouly, 2002; Mc Alister et al., 2005). 4.3.2 Germinación de los embriones somáticos maduros en medios de cultivo líquido en Sistemas de Inmersión Temporal (SIT) La germinación de los embriones somáticos en medio de cultivo líquido en los SIT se mostró condicionada a la densidad de inoculación (Tabla3). Tabla 3. Influencia de la densidad celular en el número de embriones somáticos germinados en medio de cultivo líquido (SIT), a los 20 días de cultivo. Resultados y Discusión 47 Densidad de inóculo (gMF) Nº de embriones germinados/frasco Rangos medios 15 3 8,60 d 20 12 15,15 c 25 23 23,35 b 30 37 34,90 a Letras desiguales difieren por prueba no paramétrica de Kruskall Wallis para p 0,05 De las cuatro densidades de inóculo estudiadas el mayor número de embriones somáticos germinados se obtuvo con la densidad de 30g de embriones por frasco (Figura 8), alos 20 días de cultivo, existiendo diferencia significativa con el resto de las desidades. Escalant et al. (1994), en diferentes cultivares de Musa spp. y Navarro et al. (1997) en Musa acuminata, obtuvieron entre 60-70% de germinación de embriones somáticos en un SIT tipo RITA. Gómez et al.(2002), lograron el mayor porcentaje de germinación en SIT tipo cuando utilizaron 2.0g de embriones somáticos maduros en 200ml de medio de cultivo en el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB),obteniendo 748 plantas lo que represento el 89.3% de germinación. Resultados y Discusión 48 En SIT de 10 L Barranco (2002) obtuvo un porcentaje de germinación de 72.4%al utilizar 70gMF de embriones somáticos maduros en el cultivar híbrido FHIA-18 (AAAB). López (2006) en el cv Navolean, alcanzó un 83,0% de embriones germinados, en SIT tipo RITA a la densidad de 0,5 gMF de embriones, con diferencias significativas del resto de los tratamientos estudiados. Cuando se utilizó el doble de la densidad de inoculación de los embriones somáticos (1,0 gMF) se afectó el porcentaje de germinación. Esto probablemente debido a que al existir un mayor número de embriones somáticos, la competencia por las sustancias nutritivas dentro del SIT aumentó. El efecto positivo de los SIT parece estar relacionado con la manera de utilizar el medio de cultivo líquido. El cultivo por inmersión temporal combina las ventajas de inmersión constante con las de inmersión parcial con soporte inerte (Alvard et al., 1993; Mc Alister et al., 2005). La superficie completa del material vegetal en los SIT está en contacto uniforme con los componentes del medio de cultivo, aún cuando no están sumergidos, porque una película de medio de cultivo se detiene sobre los tejidos vegetales por capilaridad. Dicha película es demasiado delgada para inhibir el intercambio gaseoso y cada vez que se hace una inmersión de nuevo se renueva su composición química (Teisson y Alvard, 1995; Curtis, 2005). Resultados y Discusión 49 La aireación es mejor y se renueva el ambiente con cada inmersión, también ocurre una agitación del material vegetal de duración corta, todo esto en su conjunto ha permitido la germinación de embriones somáticos de varias especies de Citrus, Musa y Coffea que no era posible en Erlenmeyer o biorreactores y se obtuvo con los Sistemas de Inmersión Temporal (Teisson y Alvard, 1995). Desde el punto de vista productivo con los SIT se produce un ahorro considerable de espacio en las cámaras de crecimiento, aspecto este importante con el fin de validar el proceso para la producción a gran escala, en la introducción de determinados genotipos promisorios para la agricultura. (A)-15g (C)-20g (C)-25g (D)-30g Resultados y Discusión 50 Figura 8.Embriones somáticos en SIT. Densidades de inóculo15g (A), 20g (B), 25g (C), 30g (D) Conclusiones 50 5. CONCLUSIONES 1. El mayor número de embriones somáticos formados en el cv. FHIA 21 (Musa AAAB), se logró con la densidad de 3,0% de VCS, en medios de cultivo líquido, con un tamaño entre 20-80µm, a los 45 días de cultivo. 2. La mejor densidad de inóculo para la maduración fue 600 mgMF de embriones somáticos, los que alcanzaron un tamaño entre 1,0-2,5 mm, lográndose a los 30 días de cultivo un porcentaje de germinación de 47,72%. 3. Se logró la mayor cantidad de embriones somáticos germinados en SIT de 1,75 l cuando se utilizó la densidad de inóculo de 30 gMF, a los 20 días de cultivo. Bibliografia 7. BIBLIOGRAFIA Agramonte D, Pérez J, Pérez M & Pérez A.1993. Empleo del hipoclorito de sodio (NaOCL) en sustitución del flameo en el cultivo de tejidos Centro Agrícola 2:88-89 Ahloowalia BS, Prakash J, Savangikar VA & Savangikar C. 2004. Plant tissue culture. Proceedings of low cost options for tissue culture technology in developing countries. FAO/IAEA Vienna, Austria 26-30 Agost 2002. pp 3-10. 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