Estandarización de parámetros para mejorar la eficiencia de la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en Phaseolus vulgaris L. var CIAP 7247F

Fecha

2012-07-09

Autores

Martirena Ramirez, Amanda

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Editor

Universidad Central ´´Marta Abreu´´ de Las Villas

Resumen

El frijol común presenta dificultades para la transformación genética, que van desde la introducción de genes, hasta la regeneración de plantas, pasando por problemas como la falta de reproducibilidad, desigual aplicabilidad para todas las variedades y la baja eficiencia de transformación. El presente trabajo tuvo como objetivo estandarizar parámetros para la transformación genética vía Agrobacterium tumefaciens en callos de Phaseolus vulgaris L. var. CIAP 7247F, a través de la expresión transitoria de la β- glucuronidasa, y el chequeo molecular de las líneas de plantas supuestamente transformadas mediante la RCP. Los callos se transformaron con las cepas de Agrobacterium tumefaciens EHA105 y C58C1 con los vectores de transformación pTJK136 y pCAMBIA3301. Los parámetros evaluados en la transferencia de ADN fueron: cepa bacteriana, plasmidios, condiciones de iluminación, concentración bacteriana, tiempo de subcultivo y la concentración mínima inhibitoria del agente selectivo. La mayor expresión gus transitoria se alcanzó al emplear como explantes, callos organogénicos en el segundo subcultivo de multiplicación, con la cepa EHA 105 (pCAMBIA3301), con fotoperíodo de 16-8 horas de luz/oscuridad, una concentración bacteriana de 0.5 de DO600 y con el empleo de 0.50 mg.l-1 de glufosinato de amonio como la concentración mínima inhibitoria para la selección de los callos. En estas condiciones se logró hasta el 50% del área del callo cubierta de puntos azules. La frecuencia de regeneración lograda fue de 3,05%. A través del análisis histoquímico se identificaron dos líneas genéticamente modificadas estables. El uso de la RCP permitió confirmar que los transgenes fueron transferidos de las plantas inicialmente transformadas, a sus progenies.
Common bean presents difficulties for the genetic transformation that vary from the introduction of genes to regeneration of plants, going through problems such as lack reproducibility, unequal applicability for all the varieties and the drop of transformation efficiency. The present work aimed to standardize parameters for the genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens in callus of Phaseolus vulgaris L. var. CIAP 7247F, through the transitory expression of the β-glucuronidase and molecular checking of lines of the pretended transformed plants by means of PCR. Calluses were transformed with the strains of Agrobacterium tumefaciens EHA105 and C58C1, with the vectors of transformation pTJK136 and pCAMBIA3301. The parameters evaluated in the transfer of DNA were: bacterial strain, plasmidos, lighting conditions, bacterial concentration, and time of subculture and minimal inhibitory concentration of the selective agent. The highest gus transitory expression was achieved by using as explants, organogenic calli in the second multiplication subculture, with the strain EHA 105 (pCAMBIA3301), under a photoperiod of 16-8 hours of light / darkness, a bacterial concentration of 0.5 of DO600 and using 0.50 mg.l-1 of ammonium glufosinato at the minimum inhibitory concentration for selecting the callus. Up to 50% of the callus area was cover of blue spots under these conditions. The frequency of regeneration achieved was 3.05%. Through the histochemical analysis, two genetically modified stable lines were identified. The use of PCR allowed confirming that the transgenes were transferred of the initially transformed plants, to its progeny.

Descripción

Palabras clave

Phaseolus Vulgaris L., Frijol, Agrobacterium tumefaciens, Transformación genética

Citación